一种整合了dCas9和iLight9O系统的方案能够实现对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中patchoulol生物合成过程的动态调控，从而提高patchoulol的产量

《Bioresource Technology》：A dCas9-integrated iLight9O system enables dynamic regulation for enhanced patchoulol biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae

光遗传学调控技术结合CRISPR/dCas9系统优化了酵母香兰醇生物合成工艺，通过引入异戊二烯利用双模块和动态调控鲨烯合成途径，显著提升了产物产量达66%和24%。

　　

李莉|王亚森|王布清|沈立群|高亚辉|林伟|李子杰

中国江苏省无锡市江南大学生物技术学院，教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，邮编214122

摘要

许多生物体已经进化出利用光的能力，这种能力通过光感受蛋白来介导多种生物过程。目前，几种光遗传传感器系统被广泛用于酵母中。然而，当这些系统被用于基因抑制以调节酵母的内源基因表达时，通常需要在目标基因的天然启动子附近插入相应的靶位点以实现精确调控。为了解决这些限制，开发了一种新型的蓝光诱导光遗传工具iLight9，这是一种与CRISPR-dCas9平台集成的一组分光遗传生物传感器。通过添加蛋白质降解标签，进一步增强了iLight9系统的稳定性。由此产生的系统被称为iLight9O，它可以通过引入特定的sgRNA来程序化地调节不同的基因。随后，采用系统的代谢工程策略在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中构建了一个高效的 patchoulol 生产细胞工厂。此外，将两步异戊二烯利用（IU）途径引入重组菌株中，以提高其 patchoulol 的生物合成能力。关键的是，iLight9O 系统被用来动态下调角鲨烯合酶（squalene synthase）的活性，这是一种在竞争性角鲨烯生物合成途径中的关键酶。这种光遗传通量控制策略使 IU 优化菌株中的 patchoulol 含量增加了 66%，MVAIU2 菌株中的 patchoulol 含量增加了 24%，显示出比静态工程方法显著的优势。

引言

光遗传系统能够利用光作为诱导刺激来精确控制基因表达（Pérez 等，2022）。作为强大的基因调控工具，它们具有高诱导性、剂量依赖性响应性和成本效益。此外，由于光是唯一的调控输入，光遗传控制与多种培养基具有广泛的兼容性（Benisch 等，2024）。另外，光作为一种经济的诱导剂，允许灵活调整光照强度和持续时间。这些固有的优势有助于微生物质框架开发的精细调节，并提高工艺的可扩展性，从而使光遗传策略在工业应用中具有很高的前景。蓝光是一种短波长刺激，具有易于控制、无需物理分离和对细胞无侵入性的特点，使其成为生物技术应用的理想诱导信号（Wang 等，2022；Xu 等，2018）。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是生物技术领域中最相关和多用途的微生物之一（Lian 等，2018）。其基因组中缺乏内源性光感受基因，这使得可以在该生物框架中实现多种光遗传开关，从而实现对多个细胞过程的正交光学控制（Pérez 等，2022）。对于酿酒酵母中的转录抑制，传统的光遗传系统通常需要在目标基因上游插入特定的调控序列以实现光诱导控制。这种方法耗时较长，尤其是在协调多个基因时，而且反复的基因组修饰可能会对宿主细胞的适应性产生不利影响。相比之下，CRISPR 干扰（CRISPRi）系统只需要设计序列特异性的引导 RNA（sgRNAs）即可实现对多个目标基因的可调谐抑制（Presnell 等，2022），从而有效规避了这些限制。因此，有必要在酿酒酵母中开发一个将光学组件与 CRISPRi 系统整合的基因调控平台。

Patchoulol 是一种倍半萜醇，由于其独特且持久的香气，被广泛用于护肤品和香水等产品中（Lee, Lee 等，2020；van Beek 和 Joulain，2018）。此外，它在制药应用中也显示出巨大的潜力，具有神经保护、抗炎、抗癌和镇痛活性。它还是化疗药物紫杉醇（paclitaxel）合成的前体（Silva-Filho 等，2016）。传统上，patchoulol 主要通过植物提取获得，这具有生产周期长、产量低和成本高的特点（Swamy 和 Sinniah，2016；Zhan 等，2014）。近年来，微生物生产作为一种可持续的替代方案受到了越来越多的关注。因此，包括 patchoulol 在内的多种高价值萜类化合物已通过异源表达在工程化的微生物细胞工厂中成功生产（Aguilar 等，2020；Ma 等，2019；Peng 等，2023）。酿酒酵母因其高安全性、遗传特性明确、葡萄糖利用效率高和生长速度快而被广泛用于萜类化合物的合成（Kong 等，2023；Q. Mo 等，2022）。值得注意的是，酿酒酵母具有内源性的甲瓦龙酸（MVA）途径，可以生物合成法尼基焦磷酸（FPP）。作为 patchoulol 合成的直接前体，FPP 可以通过外源 patchoulol 合酶（PTS）的催化转化为 patchoulol（Paramasivan 和 Mutturi，2017；Vickers 等，2017）。此前，已经在酿酒酵母中成功构建了一个用于生产 patchoulol 的合成细胞工厂（Asadollahi 等，2007）。随后，patchoulol 的生物合成途径得到了进一步优化，显著提高了 patchoulol 的产量（Tao 等，2024）。

在这项研究中，我们基于 VVD 蛋白开发了一个光敏系统，并创新地将其与 CRISPR/dCas9 系统结合，构建了 iLight9。为了解决泄漏表达的问题并提高整体稳定性，我们采取了包括在光敏蛋白和结合蛋白之间加入连接子（2T1）以及在 dCas9 中融合蛋白质降解标签（SULI）等策略。这导致了改进后的版本 iLight9O 系统的诞生。基于酿酒酵母的内源 MVA 途径，通过系统的代谢工程构建了一个高效的 patchoulol 生产细胞工厂。为了简化生物合成途径并提高产量，引入了两步异戊二烯利用（IU）模块。角鲨烯是酿酒酵母中膜生物发生的关键前体。角鲨烯的生物合成途径与 patchoulol 的合成途径存在竞争。通过 iLight9O 系统动态调节角鲨烯的代谢通量，显著提高了 patchoulol 的产量，同时保持了细胞的强劲生长和生理适应性。

试剂、质粒和菌株

PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶是从 TaKaRa（日本大津）购买的。质粒提取、DNA 凝胶纯化和 PCR 产物纯化试剂盒是从 TransGen Biotech（中国北京）购买的。patchoulol 和角鲨烯的纯标准品是从 Aladdin（中国上海）获得的。本研究中构建的所有质粒列在表 S1 中。同源重组酶是从 ABclonal（中国苏州）购买的。引物的合成以及...

单组分光遗传传感器系统的开发、优化和验证

来自 Neurospora crassa 的 VVD 蛋白在蓝光照射下能够形成同二聚体（Chen 等，2016）。基于这一特性，开发了 LightOn 系统，以实现哺乳动物细胞和小鼠中目标基因转录的快速诱导（Wang 等，2012）。此外，yLightOn 系统进一步被改造用于酵母细胞中的光遗传控制（Xu 等，2018）。在这项研究中，yLightOn 系统被修改以增强其...

结论

在这项研究中，通过将蓝光响应的单组分传感器与 dCas9 系统集成，开发了一种新型的光遗传工具 iLight9。此外，通过优化 dCas9 降解融合标签，创建了更先进的 iLight9O 系统。该工具通过结合蓝光诱导和 sgRNA 导向的目标定位，在酿酒酵母（S. cerevisiae）中实现了快速、可逆和可编程的基因调控。此外，在酿酒酵母中构建了一个高效的 patchoulol 生产细胞工厂...

CRediT 作者贡献声明

李莉：撰写——原始草稿、方法学、研究、形式分析、概念化。 王亚森：方法学、研究。 王布清：方法学。 沈立群：研究。 高亚辉：形式分析。 林伟：监督。 李子杰：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、监督、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2025YFF1107300）和国家自然科学基金（32171475）的支持。