工程改造的谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）：通过提高产物耐受性和外排转运能力实现1,5-戊二胺的生产

《Bioresource Technology》：Engineering Corynebacterium glutamicum for 1,5-pentanediamine production via enhanced product tolerance and efflux transport

微生物生产1,5-戊二胺通过整合胞内和胞外耐受工程策略实现高效合成，理性筛选鉴定膜相关耐受靶点cgl1283并利用适应性实验室进化（ALE）增强胞外耐受性，同时工程化CgmA转运蛋白降低胞内积累毒性，最终构建的LF6.1菌株在5L生物反应器中以葡萄糖为底物实现130g/L PDA产量、0.40g/g葡萄糖产率和3.94g/L/h生产速率。

　　

宋龙飞|张兰东|刘佳|李晓敏|魏万清|胡贵鹏|宋伟|吴静|刘立明|高聪

江南大学生物技术学院及教育部工业生物技术重点实验室，中国无锡214122

摘要

1,5-戊二胺（PDA）是一种在纺织、医药和农业领域具有广泛应用的重要单体。然而，其微生物生物合成过程受到细胞毒性的严重限制，主要原因是发酵过程中在细胞内迅速积累。为了解决这一问题，在Corynebacterium glutamicum中采用了双重耐受性工程策略来减轻细胞内和细胞外的压力。首先通过理性筛选确定了与膜相关的耐受性靶点，然后通过适应性实验室进化（ALE）发现了一个新的决定因子cgl1283，显著提高了细胞外对PDA的耐受性。同时，通过工程改造高活性的CgmA外排转运蛋白突变体来最小化细胞内PDA的积累，从而减轻了细胞毒性。在5升生物反应器中的后续工艺优化使LF6.1菌株能够从葡萄糖中生产出130克/升的PDA，产率为0.40克/克，生产速率为3.94克/升/小时。这些结果共同建立了一个综合框架，整合了细胞内和细胞外耐受性工程，为微生物生产有毒但高价值的化学品提供了一种有效策略。

引言

1,5-二氨基戊烷（PDA）是合成聚酰胺（如PA5X）的关键单体（Yang等人，2021年），并在聚合物材料、农业、航空航天和医疗设备行业中有广泛的应用（Qi等人，2024年）。传统的PDA生产主要依赖于化学合成，特别是戊二腈的氢化（Ma等人，2021年）。然而，随着对石油枯竭和气候变化的关注增加（Pellegrini等人，2024年），对可再生和可持续替代品的需求也在上升。

PDA的生物生产已经通过两步全细胞催化（Ma等人，2015年）和一步微生物发酵（Liu等人，2024年）实现。在前一种方法中，葡萄糖首先被转化为赖氨酸，然后脱羧生成PDA。例如，一种工程改造的赖氨酸脱羧酶（LDC）突变体M3（EcCadA^V12C/D41C）在碱性条件下表现出更好的稳定性，并通过全细胞催化在5升生物反应器中生产出了418克/升的PDA（Gao等人，2022b年）。虽然这种方法具有高转化效率和快速合成能力，但它需要两种不同的微生物宿主（赖氨酸生产菌和LDC宿主），从而增加了工艺设计的复杂性并延长了生产周期。因此，直接微生物发酵PDA受到了越来越多的关注。

已经有多种微生物宿主被工程改造用于从廉价底物中生产PDA，包括大肠杆菌（M. Li等人，2025年）、C. glutamicum（Kim等人，2020年）、Halomonas属菌（Zhao等人，2022年）、Methylosinus trichosporium OB3b（Singh等人，2022年）和Bacillus methanolicus（N?rdal等人，2015年）。其中，C. glutamicum是一种革兰氏阳性细菌，具有公认的安全性（GRAS）状态、快速生长能力和强大的抗逆性，已被广泛应用于l-赖氨酸的工业生产（Liu等人，2023年）。与其他微生物平台相比，C. glutamicum具有更强的赖氨酸生物合成能力和更高的PDA耐受性。然而，由于缺乏内源性的LDC，它不能自然合成PDA。为了克服这一限制，已将异源LDC引入赖氨酸生产菌株中（Kind等人，2014年；Oh等人，2015年）。通过从多种来源筛选LDC并优化启动子，发现了一种最佳配置——在组成型启动子P_H30下表达HaLdcC——从而产生了125克/升的PDA，生产速率为1.79克/升/小时，产率为0.34克/克葡萄糖（Kim等人，2018年）。

尽管取得了这些进展，但过量的PDA积累会通过抑制细胞活性和触发孔蛋白关闭而引起严重的细胞毒性，从而阻碍PDA的合成和细胞生长（Qian等人，2011年）。为了减轻这种抑制作用，采用了结合紫外线/可见光照射与大气压和室温等离子体（ARTP）处理的随机突变方法来生成耐PDA的突变体。鉴定出几个与耐受性相关的决定因子，包括HokD、PhnI和PuuR，所得菌株能够生产出58.7克/升的PDA，产率为0.396克/克葡萄糖（Wang等人，2021年）。这些发现表明，耐受性工程可以提高PDA的生物合成效率。通过随机突变引入的突变并不总是有益的，因为它们可能会产生代谢冲突，即耐受性的提高以牺牲产率为代价。为了同时提高PDA的生产和耐受性，可以采用全基因组测序与逆向代谢工程相结合的方法来筛选和选择性地引入有益的生产增强靶点。

在这项研究中，使用了一种过量产生赖氨酸的C. glutamicum菌株作为PDA生物合成的基础菌株。通过LDC筛选、启动子优化、副产物消除和拷贝数调整构建了生产PDA的菌株。为了减轻由于PDA快速积累引起的细胞外毒性，结合了理性靶点筛选和适应性实验室进化（ALE），并通过工程改造CgmA转运蛋白突变体来增强外排活性，从而减轻了细胞内毒性。最终得到的最佳菌株LF6.1在补料批次发酵中达到了130克/升的PDA浓度、0.40克/克的产率和3.94克/升/小时的生产速率，这是迄今为止报道的最高PDA生产浓度、产量和生产速率。

部分摘要

菌株和质粒

所有细菌菌株（表S1）、质粒（表S2）和引物（表S3）列在支持信息中。这些菌株和质粒的构建使用了Vazyme Biotech的一步克隆试剂盒和Takara Bio的连接克隆技术。C. glutamicum中的所有基因敲除、替换和插入都是通过使用pK18mobsacB质粒进行同源重组完成的。

培养基

使用LB培养基（5.0克/升酵母提取物、10.0克/升蛋白胨和10.0克/升NaCl）

改造C. Glutamicum以实现高效PDA生产

LDC是PDA生物合成中的关键酶步骤（图1a）。在这项研究中，使用了我们实验室保存的一种过量产生赖氨酸的C. glutamicum菌株（CCTCC 2023742；赖氨酸生产数据见补充图1）作为LDC筛选的基础菌株。评估了五种先前报道的高活性LDC——EcLdcC（Kind等人，2014年）、EcCadA（Liu等人，2024年）、HaLdcC（Kim等人，2020年）、LdcEt和LdcAer（Xue等人，2020年）——在C. glutamicum CCTCC中的全细胞催化作用

结论

在这项研究中，通过结合HaLdcC的表达和消除副产物形成，构建了一种高产PDA的C. glutamicum菌株（图6），从而将代谢流重新导向PDA合成。对细胞内和细胞外的PDA毒性进行了表征，并确定了限制生产的瓶颈。通过理性和半理性工程方法生成了耐PDA的变体，并优化了CgmA转运蛋白以获得具有...

CRediT作者贡献声明

宋龙飞：撰写——原始草案。张兰东：软件支持。刘佳：软件支持。李晓敏：数据整理。魏万清：实验研究。胡贵鹏：实验研究。宋伟：实验研究。吴静：数据分析。刘立明：软件支持。高聪：撰写——审阅与编辑，资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金一般项目（22378164, 32470059）、榆林清洁能源创新研究院能源革命科技项目（E411040705）和江苏省基础研究计划的支持，同时也得到了江苏省合成生物学基础研究中心（BK20233003）的支持。