《Bioresource Technology》：A pH-Responsive and recyclable homogeneous carbonic anhydrase with 24-polymeric fusion protein: Simple preparation and enhanced catalytic performance
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古酶融合铁蛋白实现pH响应式可回收均相催化体系，通过AncCA19与铁蛋白C末端融合形成24聚体酶-铁蛋白融合蛋白（msAncCA19F），近中性pH下自组装为微米级颗粒，经低速离心纯化后，在碱性pH下可自发解聚为纳米级均相催化剂，循环10次活性保持率>90%，显著提升催化稳定性和可回收性，简化酶纯化流程。
杨春|吴志成|陈亚欣|周彦红|张瑞芳|江伟|葛慧华|张光亚
华侨大学生物工程与生物技术系，中国福建省厦门市361021
摘要
酶是高效的绿色生物催化剂。然而，复杂的制备过程、较差的稳定性和不可重复使用性限制了它们的应用。尽管化学/基因修饰可以提高其可回收性，但目前还缺乏能够一次性解决所有这些问题的策略。本文提出了一种新的策略，即基于肽的可回收均相生物催化剂，并以祖先碳酐酶（AncCA19）为例进行了研究。将铁蛋白融合到AncCA19的C末端，得到了酶-铁蛋白融合蛋白（EFFPs）。这些蛋白在宿主细胞中可以自组装成微米级的AncCA19F（msAncCA19F），并通过低速离心分离纯化，从而简化了纯化流程并提高了产率。有趣的是，随着pH值的升高，msAncCA19F在体外可以自发溶解为纳米级的AncCA19F（nsAncCA19F），这种纳米级形式的AncCA19F表现出更好的催化性能——在人工海水中，其半衰期增加了9倍；在25% N-甲基二乙醇胺（MDEA）溶液中，半衰期增加了2倍。当pH值降低时，nsAncCA19F可以自发聚集为msAncCA19F，这种形式的AncCA19F作为可回收的固定化生物催化剂，经过10次循环后活性损失可忽略不计（<10%）。该策略不仅实现了酶的高效和可扩展制备以及简单的回收，还提高了其稳定性。本文还探讨了具有改进性能的AncCA19F的机制及其对pH变化的响应性。
引言
作为主要的生物催化剂，酶由于其高特异性和催化效率被广泛应用于医学、生物学、化学工业等领域。然而，复杂的纯化过程和高成本（Klein-Marcuschamer等人，2012年）、难以回收以及在恶劣环境下的易失活性严重限制了它们的应用（Ndochinwa等人，2024年）。近年来，通过基因组挖掘或计算机辅助酶工程发现或重新设计高稳定性和高活性的新酶已成为研究热点和前沿（Shi等人，2025年）。此外，酶的固定化也是提高其可重复使用性的另一种可行方法（Ouyang等人，2024a）。例如，通过将牛碳酐酶（bCA）与自组装肽P114（在适当条件下可自组装成纳米纤维，氨基酸序列：QQRFEWEFEQQ）通过GS接头（氨基酸序列：GGGGSGGGGS）融合，构建了能够自组装成纳米颗粒的酶-肽融合蛋白（EPFPs），赋予了bCA自组装特性（Shanbhag等人，2016年），从而解决了酶的分离和回收问题。尽管EPFPs在催化反应前后都能保持纳米颗粒形态，但这些颗粒太小，难以通过微孔膜有效回收。因此，基于酶-聚合物 conjugates（EPCs）的均相催化固定化酶的开发仍是一个具有挑战性的课题。具体来说，将超分子两亲性聚合物（β-CD@SMA，含有β-环糊精的苯乙烯马来酸）与酶结合，制备出能够自组装成超分子纳米颗粒的酶（Ouyang等人，2024b）；通过精确的“原位”聚合过程调节EPCs的临界溶解温度，将其与葡萄糖氧化酶的糖基部分结合，以提高性能（Wang等人，2024年）。pH响应性的长链聚(DMAPA)（pDMAPA，聚(N,N-二甲氨基丙基丙烯酰胺)）与抑制性聚合物NIPAm/AGA（NIPAm：N-异丙基丙烯酰胺，AGA：N-丙烯酰-D-葡萄糖胺）共价结合，构建了pDMAPA40-b-pNIPAm10/pAGA10-酶（右下角的数字分别代表相应聚合物的长度），并通过pH调节聚合物的长度来控制酶的活性和稳定性（Rahman等人，2025年）。
然而，EPCs方法无法解决复杂的酶纯化问题（Robinson，2015年）。由于大规模生产酶的下游处理成本（包括纯化）占总成本的50-80%（Yuan等人，2023年），因此开发经济高效且简单的酶分离和纯化技术迫在眉睫。一些先前的研究发现，铁蛋白作为一种24聚体纳米笼，可以作为多功能标签用于构建酶-铁蛋白融合蛋白（EFFPs），通过低速离心显著简化了酶的分离和纯化过程。铁蛋白的多功能性已在木聚糖酶（Ge等人，2024年）、地衣酶（Wang等人，2017年）、角质酶（Chen等人，2024年）以及三种不同的碳酐酶（Liu等人，2024年，Liu等人，2022年，Mao等人，2024年）中得到验证，这些酶的尺寸约为20纳米，通过透射电子显微镜（TEM）确定。除了纯化之外，基于EPCs的方法还存在其他缺点，如聚合物合成过程相对复杂（Shaikh等人，2025年），在温和条件下成功结合酶与合成聚合物的产率较低，而在苛刻条件或复杂过程中可能会产率提高，从而导致酶活性下降甚至丧失。此外，某些合成聚合物可能对细胞具有潜在毒性（Dankers和Meijer，2007年）。铁蛋白具有高度保守的三级结构，与其他自组装肽形成的不规则聚集体相比，铁蛋白可以稳定地形成24聚体。因此，与铁蛋白融合构建的EFFPs也是24聚体。这种无载体固定化方法通过在酶末端添加自组装蛋白，使酶在表达过程中开始自组装并形成沉淀物。通过离心实现纯化的同时，也无需额外载体即可获得固定化酶，大大节省了酶纯化和固定的时间和成本。
碳酐酶（CA）在生物碳封存领域发挥着重要作用，但仍面临以下挑战（Shao等人，2024年）：在高温、极端pH值或化学溶剂等条件下稳定性较差；基于复杂色谱法的CA纯化过程成本高昂。此外，游离态的CA虽然能实现均相催化，但回收性差，而传统的固定化CA虽然可回收，但缺乏均相催化能力（Zhang等人，2022年）。
最近，通过祖先序列重构获得了一种新型碳酐酶AncCA19，其在不同的二氧化碳捕获条件下具有高活性和稳定性（Yang等人，2025年）。然而，纯化和可回收的均相生物催化仍然存在困难。本文将人源H-铁蛋白（PDB ID：2FHA）融合到AncCA19的C末端，替代了其原有的His标签，构建了24聚体AncCA19-Ferritin（AncCA19F）。在细胞内接近中性的条件下，高表达的AncCA19F形成了难溶的微米级AncCA19F（msAncCA19F），这大大促进了分离并提高了产率。在体外，msAncCA19F在高pH条件下可以溶解为可溶的纳米级AncCA19F（nsAncCA19F），通过调整pH值接近中性可以逆转这一过程，从而采用了一种新的铁蛋白标签方法解决了均相催化与异相分离之间的矛盾。更令人鼓舞的是，铁蛋白标签提高了AncCA19的热稳定性。因此，本文提出的策略与现有的EPCs不同，提供了一种简单且温和的方法来应对上述挑战。
AncCA19F的载体构建、蛋白表达、纯化和鉴定
目标基因AncCA19F由苏州Genewiz生物技术有限公司合成，然后通过NdeⅠ和HindⅢ限制性内切酶插入质粒pET-22b(+)中。成功构建的重组质粒pET-AncCA19F被导入表达菌株大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中。
含有重组质粒的大肠杆菌BL21以1%的接种量接种到含有氨苄西林的LB培养基中，并在37℃和200 rpm下活化过夜。
AncCA19F的生物合成和表征
通过将铁蛋白的编码基因添加到AncCA19基因的3′末端，并将质粒pET-22b插入，构建了重组质粒pET22b-AncCA19-Ferritin（图1a）。该质粒过表达的24聚体AncCA19-Ferritin（AncCA19F）可以在宿主细胞中自组装成微米级的AncCA19F（msAncCA19F）聚集体，可通过低速离心纯化。当离心力达到4000 rcf时，...
结论
本文设计了一种基于肽的酶-铁蛋白融合蛋白（EFFPs），不仅有效简化了纯化过程并提高了产率，而且根据缓冲液的pH值可作为可回收的均相生物催化剂使用。AncCA19F在接近中性的缓冲液（pH ≤ 7.5）中可以聚集为msAncCA19F，随着pH值的升高会自发溶解为nsAncCA19F。这些特性使得AncCA19F能够在均相催化和...
CRediT作者贡献声明
杨春：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始稿，验证，方法学，概念化。
吴志成：可视化，软件，方法学。
陈亚欣：可视化，软件，方法学。
周彦红：方法学，概念化。
张瑞芳：方法学，概念化。
江伟：可视化，软件。
葛慧华：监督，资源提供。
张光亚：撰写 – 审稿与编辑，可视化，资源提供，项目管理，实验研究。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
