通过过表达PIR3和SPI1基因来提高酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的耐受工程应力能力，从而实现从高浓度甘蔗糖蜜中高效生产乙醇

《Bioresource Technology》：Engineering stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae by overexpressing PIR3 and SPI1 for efficient ethanol production from high-concentration sugarcane molasses

通过多组学分析和CRISPR基因编辑，揭示了高浓度甘蔗糖蜜中钾钙离子共存的胁迫机制，鉴定出PIR3、SPI1、AQR1和GUT2四个关键基因，其中PIR3和SPI1维持细胞完整性，AQR1和GUT2调控代谢通量，工程菌株乙醇产量提升24.6%，同时肉桂酸合成增加12.5%。

　　

魏阳王|廖蓓|郑萍|黄明月|魏宇拓|牛福星

广西科技大学糖资源绿色加工重点实验室，中国柳州545006

摘要

钾离子和钙离子的共存已被确定为限制高浓度甘蔗糖蜜中Saccharomyces cerevisiae高产乙醇发酵的主要因素。为了识别赋予这种压力耐受性的关键基因，我们采用了一种综合策略，结合了多组学分析、CRISPR介导的基因激活/抑制和靶向过表达。这种方法确定了四个关键基因：PIR3、SPI1、AQR1和GUT2。功能分析表明，AQR1和GUT2主要通过重新定向代谢流来增强乙醇生物合成，而PIR3和SPI1对于在压力下维持细胞完整性和活力至关重要。在野生型菌株中过表达PIR3和SPI1使乙醇产量增加了24.6%，在5升发酵罐中的最终浓度达到了113.3克/升，这一表现与强健的工业菌株相当。此外，这种工程策略还提高了其他有价值化合物的合成，例如肉桂酸的产量增加了12.5%。因此，我们的工作确定了用于工程化耐压酵母的精确遗传靶点，并为高浓度甘蔗糖蜜的高效生物转化奠定了基础。

引言

化石燃料的日益枯竭和日益严重的环境问题迫使全球转向可持续能源替代品。作为可再生且碳中性的能源，生物乙醇在减少温室气体排放和降低对不可再生资源的依赖方面发挥着关键作用（Wang等人，2024年）。为了满足对可持续能源不断增长的需求，第二代生物乙醇技术因其利用非食品生物质（如稻草（Sukma等人，2024年）、甘蔗渣（Ojo-Kupoluyi等人，2024年）和其他纤维素材料，以及工业废弃物（如糖蜜（Parascanu等人，2021年）而受到广泛关注。这种方法使得绿色生物制造与成本效益高的生物乙醇生产相结合，从而促进了良好的生物经济价值，并有助于环境可持续性（Afedzi等人，2025年）。

在各种原料中，甘蔗糖蜜因其经济和生态优势而成为生物乙醇生产的有前景的原料。作为糖精炼的副产品，糖蜜富含可发酵糖（蔗糖、葡萄糖和果糖），提供了一种成本效益高且可再生的资源，避免与粮食作物竞争（Lino等人，2018年；Raghavi等人，2016年）。其利用符合循环经济原则，通过利用工业废弃物来减少与处置相关的环境负担。此外，由糖蜜衍生的乙醇生产减少了土地使用冲突，解决了与第一代来自可食用作物的生物燃料相关的伦理问题。尽管有这些优势，但利用甘蔗糖蜜生产乙醇仍面临若干技术和生物学挑战。糖蜜复杂的组成，包括重金属、酚类化合物和过量盐等非糖杂质，会抑制酵母代谢并降低发酵效率（Lino等人，2018年；Wang等人，2024年）。高糖浓度可能会对Saccharomyces cerevisiae造成渗透压应力，影响细胞活力和乙醇产量。此外，由于甘蔗品种和加工条件的不同，糖蜜质量不稳定，使得工艺标准化变得复杂。当前的发酵系统还面临副产物积累的问题（例如甘油和有机酸），这会将碳流从乙醇合成中分流出去。要克服这些限制，需要在菌株工程、预处理优化和过程控制方面采取创新策略，以提高基于糖蜜的生物乙醇生产的经济可行性。

要从高浓度甘蔗糖蜜（HCSM）中实现高效的乙醇发酵，需要克服其主要抑制性压力因素。先前的研究已经证明，K⁺和Ca²⁺的共存是限制S. cerevisiae在糖蜜中高效合成乙醇的主要因素，这些研究采用了ARTP诱变、适应性进化、高通量筛选和组学分析的综合方法（Wang等人，2024年）。为了识别调控这种细胞反应的具体遗传介质，并确定哪些基因控制关键的表型结果，我们进行了全面的遗传筛选，结合了跨组学分析、CRISPR基因编辑（激活和抑制）以及单基因/多基因表达。本研究首次识别并验证了一组新基因，尤其是PIR3和SPI1，它们是K⁺和Ca²⁺压力下细胞形态的关键调节因子，从而为之前观察到的现象提供了机制上的理解。

章节片段

菌株、质粒和引物

本研究中使用的S. cerevisiae菌株和质粒总结在表S1中。本研究中使用的引物总结在表S2中。

质粒的构建

本研究中使用的所有质粒列在表S1中。关键质粒包括CRISPR-VPR载体（pRS415-Cas9-VPR-NrsR和pRS423-TyrSgH-KanMX）和基因过表达载体（Yep352-KanMX），均使用无缝组装克隆技术构建（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit，Genesand，中国）。肉桂酸生物合成质粒

突变基因的筛选

基于K⁺和Ca²⁺共存是HCSM发酵中的关键压力因素的发现（Wang等人，2024年），我们试图识别这种反应的遗传介质。与野生型菌株 GJ08在相同的发酵条件下相比， NGTM-F1表现出1920个差异表达基因（DEGs），其中包括795个上调基因和1125个下调基因（图S1）。同样， NGK⁺&Ca²⁺-F1显示了215个DEGs，其中77个上调基因和138个下调基因

结论

本研究确定了PIR3、SPI1、AQR1和GUT2作为工程化Saccharomyces cerevisiae耐受性和提高高浓度甘蔗糖蜜乙醇产量的关键遗传靶点。过表达与细胞壁相关的基因PIR3和SPI1赋予了强大的耐压性，而抑制代谢调节因子AQR1和GUT2则将碳流重新导向乙醇合成。这一策略不仅使乙醇产量在扩大规模发酵中增加了24.6%

CRediT作者贡献声明

魏阳王：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，研究，数据管理。廖蓓：可视化，研究。郑萍：可视化，研究。黄明月：撰写 – 审稿与编辑。魏宇拓：撰写 – 审稿与编辑，研究，资金获取，概念构思。牛福星：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，研究，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢浙江大学的连家昌教授慷慨提供CRISPR-VPR系统，以及广东中医药大学的王奎教授友好地贡献了pRS42H-Cas9-NAT系统。他们的智慧贡献和物质支持对这项研究的技术实施至关重要。

本研究得到了国家自然科学基金（批准号：32260246）和广西科技大学博士基金的资助