《Biosensors and Bioelectronics》：Programmable AND-Gate Strategy to Reduce False Positives in Rolling Circle Amplification
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提高生物传感器特异性以降低假阳性率是点-of-care诊断长期挑战，本研究开发多关键RCA技术通过AND门逻辑需同时检测多个核酸序列，显著减少假阳性并实现SNP检测，可整合至侧流试纸条形成无需专业设备的POC诊断平台，支持RNA检测及多输入扩展，并通过一锅式反应实现冻干长期存储。
Jiho Seok|Mark P. Styczynski
佐治亚理工学院化学与生物分子工程学院，美国乔治亚州亚特兰大，邮编30332-0100
摘要
通过降低生物传感器的假阳性率来提高其特异性是一个长期存在的挑战，尤其是在即时诊断（POC）领域。一类新兴且可能具有影响力的POC生物传感器是能够检测特定核酸序列的传感器。这些传感器通常使用核酸序列的等温扩增技术，由于其相对简单且不需要特殊设备或高度训练的人员，因此被认为适合用于POC应用。然而，等温扩增方法仍然容易产生假阳性结果，尤其是像滚环扩增（RCA）这样的方法，在温和的温度条件下扩增核酸时更容易发生接近目标的扩增。为了解决这一限制，我们引入了AND门布尔逻辑，创建了多键RCA（Multi-Key RCA），该技术将检测多个核酸序列作为扩增的前提条件。与传统的RCA相比，多键RCA不仅显著减少了假阳性率，还在单核苷酸多态性（SNP）检测中实现了高特异性。我们还证明了多键RCA可以检测RNA，并且可以扩展到使用超过两个输入的AND门。我们将多键RCA与侧向流动检测（lateral flow assay）结合，创建了一个无需特殊设备的用户友好型合成生物学诊断平台，并展示了这种诊断方法可以作为一个一体化的反应过程进行，所有RCA步骤都包含在内，而且可以冻干以保持长期稳定性。总体而言，这种基于布尔逻辑的合成生物学方法在减少现场可部署的核酸生物传感器的假阳性方面显示出巨大的潜力。
引言
合成生物学中广泛使用的一种策略是通过布尔逻辑整合生物组件，以创建根据用户定义的输入进行工作的可编程电路（Bressler等人，2023年）。这种方法已经远远超出了早期在细胞中编程基因电路以调节转录的研究范围，目前的努力包括在无细胞环境中构建基于DNA的逻辑计算系统，这些系统可用于智能诊断（Konry和Walt，2009年；Ma等人，2021年；Manzoni等人，2016年）。这样的方法具有高度的模块化特性，因为通过简单的序列修改可以重新配置目标特异性检测。使用AND门（只有当所有指定输入都存在时才产生输出）可以在诊断应用中实现高特异性和低假阳性率（Erbas-Cakmak等人，2018年）。
等温扩增技术可以在不进行热循环的情况下扩增核酸，具有实现基于合成生物学的传感的巨大潜力（Zhao等人，2015年）。一些最常用的等温扩增方法包括环介导的等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、基于核酸序列的扩增（NASBA）和滚环扩增（RCA）（Xia等人，2022年）。这些方法不需要复杂的仪器或训练有素的人员，因此适用于即时诊断（POC）应用（Craw和Balachandran，2012年）。
在这些方法中，RCA在相对较低的温度（30-37°C）下表现出最佳活性，使其特别适用于POC生物传感应用（Ali等人，2014年）。RCA使用“挂锁探针”，这是一种线性的单链DNA，其5′和3′端的序列与目标寡核苷酸序列互补。当目标序列存在时，它会与挂锁探针的两端结合，然后连接酶将暂时环化的分子转化为永久环化的单链DNA。环化的DNA作为DNA聚合的模板；当与能够置换双链区域的高效DNA聚合酶结合时，可以合成长的重复单链DNA作为传感器输出。这种DNA可以通过多种方式检测到，包括通过侧向流动检测（LFAs）进行可视化，从而创建带有比色指示器的用户友好型生物传感器（Jain等人，2021年；Lee等人，2022年）。
然而，使RCA适用于POC的低温操作范围也使其容易发生非特异性扩增，从而导致假阳性信号（Lee等人，2024年；Li等人，2019年）。当与目标序列相似的分子与挂锁探针杂交并导致传感器输出时，就会发生假阳性（Güven等人，2014年）。在较高温度下，这种不匹配的结合不够稳定，无法进行显著的连接；在RCA的温和条件下，这种不匹配的结合可能会持续存在并产生输出信号。在可能含有多种不同微生物的复杂样本中，这种情况更为明显，因为这些微生物的基因组覆盖的序列空间更大，增加了产生假阳性序列的可能性（Frutiger等人，2021年）。因此，提高RCA的特异性并最小化假阳性将是推动POC生物传感器应用的关键进展（Deng等人，2023年；Tian等人，2022年；Zheng等人，2023年）。
传感器假阳性的影响可能是巨大的，这激发了人们努力将其降到最低。例如，在复杂食品样本中检测食源性病原体时，可能存在多种微生物，从而导致假阳性（Holzapfel等人，2001年）。这可能导致将未受污染的食品误分类为受污染食品，从而导致不必要的处理、消费者担忧和经济损失（Kennedy，2008年）。在军事或社区等人口密集的环境中，病原体检测中的假阳性可能会引发不必要的隔离或治疗，浪费时间和资源，同时妨碍对真正感染的有效管理，并削弱士气（Hafslund等人，2012年；Wadl等人，2010年）。
为了解决这些挑战，我们开发了一种多键RCA，它结合了AND门逻辑，要求同时存在多个序列才能进行核酸检测。我们使用沙门氏菌的序列作为目标，沙门氏菌是美国31种主要食源性疾病病原体之一，以证明多键RCA与传统RCA相比显著减少了假阳性，并在单核苷酸多态性（SNP）鉴别中表现出高性能（Scallan等人，2011年）。我们还将该系统与用户友好的LFA平台结合，展示了其作为POC诊断工具的潜力。此外，我们还展示了模块化逻辑设计可以轻松扩展到具有两个以上输入的AND门，以及通过简单修改检测RNA序列。最后，我们证明了这种传感方法可以作为一个一体化的反应过程进行，所有RCA步骤都包含在内，并且可以冻干以保持长期稳定性。总之，这些努力证明了多键RCA在现场传感应用中的可行性。
材料与试剂
单链寡核苷酸由Eurofins Genomics和Integrated DNA Technologies合成（表S1）。T4多核苷酸激酶、T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶2、SplintR连接酶、phi29 DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸溶液混合物（dNTPs）、重组白蛋白、RNase抑制剂（鼠源）、1 kb DNA梯子和凝胶加载染料均从New England Biolabs（美国）购买。HybriDetect通用侧向流动检测试剂盒从Milenia Biotec GmbH（德国）获得。
多键RCA的工作原理
对于低温等温扩增，假阳性信号的可能性可能比大多数RCA用户意识到的要高。我们试图评估在37°C下进行的传统RCA反应中由于目标核酸序列子序列的存在而导致的假阳性扩增频率（图S1A）。使用100 pmol长度为20 nt的沙门氏菌物种的目标DNA序列，即使接近目标的DNA仅包含12 nt的序列，也发生了扩增
结论
在这项研究中，我们开发了多键RCA，它使用AND门布尔逻辑，要求同时检测多个序列目标，以解决传统RCA在常温下固有的高假阳性率问题。我们证明了这种方法显著减少了假阳性，并且可以与LFA输出结合，创建一个用户可访问的POC生物传感器。我们还证明了多键RCA的可编程AND门电路设计具有高度的模块化特性
CRediT作者贡献声明
Mark P Styczynski：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。Jiho Seok：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、资源准备、方法学设计、调查、数据分析、概念化
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢
国家科学基金会（EF-2319391）、
国立卫生研究院（R01EB034301）和佐治亚理工学院IRAD项目（I15RDNV0020）提供的资金支持。图表使用Biorender工具制作（
https://biorender.com）。
