《Biosensors and Bioelectronics》：Plasmonic magnetic nanoparticles-enabled universal enrichment, photothermal lysis, and duplex CRISPR detection of bacteria in urine samples
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快速检测尿路感染的大肠杆菌和肠球菌，采用磁纳米颗粒富集、近红外光热解及CRISPR-Cas系统联用技术，40分钟内实现10 CFU/mL超灵敏检测，临床验证灵敏度特异性均为100%。
作者列表：涂志杰|王云翔|钱翔|陈金莉|李凌云|王天慈|陈虹|魏洪娟|杨萍|潘俊平|王胜奇|荣珍
北京农业机械科学研究院生物信息中心，中国北京100850
摘要
尿路感染（UTIs）由于抗生素耐药性的增加和病原体多样性的演变而变得更为严重，因此需要快速且灵敏的诊断方法。本研究介绍了一种集成平台，该平台结合了磁富集、光热裂解和基于CRISPR的检测技术（ME-CRISPR），用于同时识别尿路感染中的大肠杆菌（E. coli）和粪肠球菌（E. faecalis）。我们设计了表面修饰有4-巯基苯硼酸的等离子体磁纳米颗粒，可在10分钟内捕获多种细菌。随后通过近红外激光照射利用局部表面等离子体共振效应在原位裂解被捕获的细菌。释放的核酸通过一步双链RPA-CRISPR/Cas12a-Cas13a检测方法进行直接分析。这一40分钟的工作流程能够检测到低至10 CFU/mL的这两种病原体浓度。通过对90个临床样本（39个E. coli、26个E. faecalis和25个阴性对照样本）的验证，显示出100%的敏感性和特异性，其性能可与qPCR相媲美，同时显著缩短了检测时间。该平台克服了离心和革兰氏染色依赖性裂解方法的局限性，提供了一种快速且超灵敏的即时检测工具，有助于遏制抗生素的滥用。
引言
尿路感染（UTIs）是由病原菌侵入泌尿系统（包括尿道、膀胱、输尿管和肾脏）引起的炎症性疾病，是全球最常见的传染病之一（Mancuso等人，2023年）。尿路感染的典型症状包括发热、尿频、尿急和排尿疼痛，严重病例可能发展为肾盂肾炎、尿毒症、菌血症甚至死亡（Flores-Mireles等人，2015年）。据统计，全球每年有超过1.5亿人患有尿路感染，女性的终生患病风险高达50%-60%（Foxman，2014年；Klein和Hultgren，2020年）。尿路感染占所有感染的近25%，复发率高达44%（Foxman，2003年；Ik?helmo等人，1996年；Suskind等人，2016年）。更严重的是，尿路感染已成为抗生素滥用的一个“灾难区”。研究表明，不必要地使用广谱抗生素是导致抗菌素耐药性（AMR）流行的主要因素（Murray等人，2022年；Von Vietinghoff等人，2024年）。这直接促进了“超级细菌”的传播，如产生扩展谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌（E. coli）、耐万古霉素的肠球菌以及耐碳青霉烯的肠杆菌科（CRE），每年在医疗保健上造成数十亿美元的损失（Magill等人，2014年；McCann等人，2020年）。
传统观点认为革兰氏阴性细菌是尿路感染的主要病原体，仅大肠杆菌就占社区和医院环境中病例的70%至95%（Foxman，2010年；Griebling，2005年；Hooton，2012年）。然而，最近的几项临床研究指出尿路感染病原体分布正在发生变化。在复杂性尿路感染（cUTIs）、医院感染和免疫抑制患者中，粪肠球菌（E. faecalis）等革兰氏阳性细菌的检出率显著增加至20%（Codelia-Anjum等人，2023年；Salm等人，2023年）。面对尿路感染细菌多样性增加和抗菌素耐药性加速演变的双重挑战，早期和准确的病原体检测对于精确的临床治疗和限制广谱抗生素的滥用至关重要。
病原体检测技术主要包括细菌培养和分子生物学检测方法，如聚合酶链反应（PCR）（Kelly，2023年；Marcus等人，2012年；Schmiemann等人，2010年）。尽管细菌培养的成本较低且标准化程度较高，但其缺点是检测过程相对较长（18小时至30小时），需要专业技术人员，并且可能受到抗生素治疗的影响，导致结果不准确。近年来，基于PCR的分子诊断技术已被广泛用于检测血液和尿液等临床样本中的病原体（Gosiewski等人，2014年；Wojno等人，2020年）。然而，PCR技术存在固有的局限性，包括依赖热循环仪进行精确温度控制、需要专用设备和训练有素的人员，以及容易受到复杂临床基质中扩增抑制剂的影响（例如尿液中的尿素或血液中的肝素）。CRISPR-Cas系统的出现通过利用CRISPR核酸酶（如Cas12a/Cas13a）的可编程切割活性彻底改变了分子诊断方法，提供了两种不同的模式：（1）无扩增的CRISPR检测利用高活性Cas酶直接切割微量核酸，检测时间快（<30分钟），但通常灵敏度有限（Fozouni等人，2021年；Li等人，2023a；Li等人，2023b）；（2）扩增耦合的CRISPR诊断结合了等温扩增技术（如重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导的等温扩增（LAMP）与CRISPR介导的辅助切割，实现了超高的灵敏度（aM水平）、室温操作和多重检测能力，从而开创了下一代即时检测平台，克服了传统方法的限制（Broughton等人，2020年；Ding等人，2020年；Wang等人，2024年）。
然而，尿路感染中细菌DNA检测仍存在一些问题需要解决：（1）在某些尿路感染中，细菌载量不足以直接检测，需要离心浓缩微生物生物量以获得足够的DNA产量。然而，尿液中含有许多容易结晶并抑制细菌DNA检测的物质，如草酸钙、尿酸、无定形磷酸盐和尿酸盐。这些结晶在离心过程中会形成大颗粒沉积物，严重影响细菌核酸检测的准确性（Staley等人，2019年）；（2）革兰氏阳性细菌的多层肽聚糖细胞壁结构对酶解和化学裂解具有很强的抵抗力。传统的商业细菌DNA提取试剂盒需要长时间的酶预处理（≥30分钟）使用溶菌酶部分降解肽聚糖，然后还需额外步骤去除残留的酶成分以避免干扰检测（Ye和Lei，2023年）。虽然机械裂解可以提高DNA产量，但DNA容易断裂成短片段，并可能在处理过程中增加气溶胶污染的风险（Chiu和Miller，2019年）。因此，开发一种无需离心、广谱裂解且不依赖纯化的核酸提取平台对于克服阻碍革兰氏阴性和阳性病原体同时检测的技术限制至关重要，从而推进下一代尿路感染分子诊断框架的发展。
近年来，功能化纳米材料为高效病原体富集提供了新的策略（Elhariry等人，2025年）。由于其超顺磁性特性和可修饰的表面，磁纳米颗粒（MNPs）已被广泛用于细菌分离和富集（Plouffe等人，2015年；Wang等人，2020年）。然而，传统的基于MNPs的方案需要额外的切割步骤来释放目标核酸，这可能会引入干扰进一步检测的抑制剂（Shan等人，2010年；Usvaliev等人，2023年）。
在这项研究中，我们设计了具有超顺磁性Fe3O4核心的Au壳/Au卫星复合等离子体磁纳米颗粒（PMNPs），用于快速分离和细菌DNA提取。外层Au壳/Au卫星结构具有双重功能：（1）表面修饰有广谱细菌识别元件4-巯基苯甲酸（4-MPBA），可以在尿液样本中同时捕获所有革兰氏阳性和阴性细菌；（2）在近红外光（NIR）激发下产生局部表面等离子体共振（LSPR）效应，在金纳米材料/细菌复合物富集后放大这一效应，实现原位光热裂解细菌，同时释放DNA并避免化学裂解试剂的干扰，为后续检测提供高浓度的模板。为了实现超灵敏和快速的核酸检测，我们将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas系统结合，构建了一个一步RPA-CRISPR/Cas12a-Cas13a诊断系统，用于尿路感染中大肠杆菌和粪肠球菌的双重检测。该平台结合了磁富集、光热裂解和RPA-CRISPR技术，建立了一个集成平台（称为ME-CRISPR），实现了大肠杆菌和粪肠球菌在40分钟内的超灵敏检测，检测限（LOD）低至10 CFU/mL。90个临床样本（包括39个大肠杆菌样本、26个粪肠球菌样本和25个阴性样本）的结果验证了该方法的可行性。与qPCR相比，其敏感性和特异性均为100%。这项工作有三个关键创新点：首先，PMNPs-MPBA设计用于无需离心的广谱细菌捕获和不受革兰氏类型影响的广谱光热裂解，从而解决了传统样本处理的主要限制；其次，建立了一步双链RPA-CRISPR/Cas12a-Cas13a检测方法，通过正交CRISPR系统在25分钟内同时特异性检测这两种病原体；第三，这些模块被完全整合到一个快速（40分钟）、超灵敏（10 CFU/mL）的工作流程中，消除了单独的DNA提取和热循环步骤。总体而言，ME-CRISPR平台为尿路感染的即时诊断提供了一种变革性的集成策略。
材料与化学品
聚乙二醇胺（PEI）支链（分子量25 kDa）、聚乙烯吡咯烷酮和Tween-20购自Sigma-Aldrich（美国）。四水合氯金酸（HAuCl4.4H2O）、盐酸羟胺、硼氢化钠和柠檬酸钠由Sinopharm Chemical Reagent Co.（中国上海）提供。2.4×107 CFU/mL的大肠杆菌（BNCC346000）和7.9×107 CFU/mL的粪肠球菌（BNCC364005）购自BeNa Culture Collection（中国河南）。4-MPBA由Aladdin提供。
ME-CRISPR原理
本文报告了一种结合磁富集-光热裂解预处理与一步RPA-CRISPR/Cas12a-Cas13a检测的即时检测方法，用于尿路感染样本中大肠杆菌和粪肠球菌的超灵敏检测。MPBA修饰的PMNPs可以从尿液中富集目标细菌，并形成多等离子体热点以实现后续的光热裂解。捕获的细菌在808 nm激光照射下直接裂解，释放细菌DNA，可以直接用于后续分析。
结论
本研究建立了ME-CRISPR这一变革性诊断平台，解决了尿路感染细菌检测中的长期技术难题。通过将磁富集、光热裂解和基于CRISPR的检测整合到一个简化的工作流程中，我们的系统在40分钟内实现了对革兰氏阴性（大肠杆菌）和革兰氏阳性（粪肠球菌细菌的超灵敏识别（低至10 CFU/mL）。关键创新包括：（1）PMNPs-MPBA纳米颗粒实现了广谱细菌捕获
CRediT作者贡献声明
王胜奇：撰写 – 审稿与编辑，监督。潘俊平：验证，资源提供。王云翔：方法学研究。荣珍：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念构思。涂志杰：撰写 – 初稿，方法学研究。钱翔：验证。李凌云：方法学研究。陈金莉：验证，实验研究。陈虹：方法学研究。王天慈：方法学研究。杨萍：验证。魏洪娟：方法学研究
未引用参考文献
Li等人，2023年。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的利益冲突。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：82472105）和北京Nova计划（资助编号：20230484317）的支持。
