《Biosensors and Bioelectronics》：Nucleic acid detection via protein readout through Cas-controlled gating of cell-free protein synthesis
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CRIVER系统通过化学修饰的DNA前体调控Cas13a和Cas12a的靶向切割，释放可延伸的DNA触发器，激活细胞-free蛋白合成实现核酸双通道检测，应用于病原体快速识别。
朴允真（Yu Jin Park）| 宋东妍（Dong-Yeon Song）| 郑惠彬（Hye Bin Jeon）| 金东明（Dong-Myung Kim）
韩国大田市儒城区大鹤路99号，忠南国立大学化学工程与应用化学系，邮编34147
摘要
我们提出了一种模块化平台，该平台将CRISPR目标识别转化为可编程的蛋白质输出，用于核酸检测。该系统将Cas介导的附带切割与无细胞蛋白质合成相结合。在目标存在的情况下，Cas介导的附带切割会释放一个具有延伸能力的触发DNA，从而控制报告基因的表达。尽管附带切割本质上是无选择性的，但通过使用具有骨架修饰的化学编程前体（此处以磷硫酯键为例），我们可以实现片段生成的确定性。以炭疽杆菌（Bacillus anthracis）和大肠杆菌 O157:H7为模型，开发的CRIVER检测方法能够同时读取16S rRNA以及物种特异性的capB或ecf1位点，通过将Cas13a介导的RNA识别和Cas12a介导的DNA识别整合到双通道工作流程中实现。总体而言，所提出的方法在蛋白质层面建立了可寻址的信号传导，支持基于蛋白质的输出，并提供了一种通用的灵敏双通道核酸检测方法。
引言
快速、灵敏且易于获取的病原体核酸检测对于及时应对传染病、监测食品安全和生物防御监视至关重要（Chakraborty 2024; Lei and Xu 2024; Minogue et al. 2019; Ndraha et al. 2023）。虽然聚合酶链反应（PCR）和等温扩增等目标扩增方法具有出色的灵敏度，但它们通常需要专门的仪器或复杂的多步骤工作流程，这增加了非集中实验室的检测复杂性和运营成本（Chakraborty 2024; Jani and Peter 2022）。这些限制促使人们寻找能够在保持分子特异性的同时简化或多样化报告层的方法（Gl?kler et al. 2021）。
基于CRISPR的核酸检测方法利用Cas核酸酶的附带切割活性，提供了一种有前景的替代方案（He et al. 2023; Shariq et al. 2023; Zhou et al. 2024）。在目标识别后，Cas12a（针对DNA）和Cas13a（针对RNA）被激活并切割附近的单链核酸。为了将这种附带活性转化为可读的输出，DETECTR和SHERLOCK等平台使用带有荧光团和淬灭剂（FQ报告基因）的短单链DNA或RNA报告基因，使得切割将荧光团与淬灭剂分离并恢复荧光（Ackerman et al. 2020; Chen et al. 2018; Gootenberg et al. 2017,2018）。FQ报告基因一直是首选，因为附带切割是无选择性的，且不会产生预定义的产物。区分不同的FQ对也可以检测不同的目标。然而，基于FQ报告基因的检测通常需要标记的报告基因和荧光测量硬件，这可能会限制其便携性，并限制在资源匮乏或仪器有限的环境中的应用。为了克服这些限制并扩大可用输出和部署范围，最近的进展将Cas12/Cas13的附带活性适应于额外的报告层，实现了比色、电化学和其他光学格式，从而提高了可访问性并扩展了检测环境（Byun et al. 2013; Kaminski et al. 2021; Lau et al. 2025; Rahimi et al. 2024; Sahel et al. 2024）。此外，还有研究试图将附带切割转化为功能性的生化触发事件，包括将其与下游的核酸扩增步骤（如转录扩增和滚环扩增（RCA）耦合，从而使目标识别启动二次反应，而不仅仅是作为终点信号（Han et al. 2023; Lee et al. 2024; Pian et al. 2024; Wang et al. 2022; Zhou et al. 2021）。然而，由于trans-切割产生的片段具有非确定性的切割位置和末端，大多数方法仍然缺乏内在的切割位置编程方式，难以一致地生成具有延伸能力的触发剂，从而阻碍了与下游门控反应的可预测功能耦合。
为了解决这一差距并在保持CRISPR识别分子灵敏度的同时扩展报告层，我们设计了一种方案，使Cas的附带切割具有位点选择性，从而释放一个定义明确的DNA触发剂，激活下游的无细胞蛋白质合成反应。我们将这种工作流程称为CRIVER（Cas调控的体外报告基因表达），反映了其设计原理：将Cas的附带活性转化为可编程的分子触发剂，完成原本不活跃的表达盒并实现报告基因的产生（Park et al. 2024b）。由于输出是基于蛋白质的，相同的识别逻辑可以轻松地与多种读出方式结合——包括荧光、发光、酶促或比色信号——从而根据灵敏度、仪器和成本要求选择合适的报告方式。
为了在统一的框架内实现针对RNA和DNA目标的这一策略，我们开发了针对Cas13a和Cas12a的附带切割特性定制的化学编程触发剂前体。对于Cas13a通道，目标识别会激活trans-切割，从前体中去除一个RNA片段，暴露出适合引物延伸的DNA 3′末端。对于Cas12a通道，嵌入触发剂前体中的磷酸二酯元件将切割限制在预定义的位置，从前体中产生确定性的触发剂。释放的DNA触发剂随后与不完全表达盒上的触发剂结合位点（TBS）结合，启动延伸以完成转录模板，从而实现无细胞报告基因的产生。这样，CRIVER不依赖附带切割作为终点读出；相反，它将目标依赖的附带活性转化为可控的触发剂生成步骤，控制下游的无细胞蛋白质合成反应。这两个模块共同将目标RNA或dsDNA识别转化为蛋白质输出，并支持模块化工作流程中的双通道RNA/dsDNA分析。
作为生物学和社会学上相关的模型，我们关注炭疽杆菌（Bacillus anthracis）和大肠杆菌 O157:H7，将RNA标记（16S rRNA）与基因组位点（capB或ecf1）配对，这种组合在保持灵敏度的同时提供了所需的特异性，以实现准确鉴定（Livezey et al. 2015; Luna et al. 2006）。总之，这种方法通过无细胞的、基因编码的输出来测量目标核酸，并支持临床、环境、工业和生物防御应用中的RNA和DNA分析。
材料
ATP、GTP、UTP、CTP、肌酸磷酸、肌酸激酶和大肠杆菌 MRE600总tRNA混合物从Roche Applied Science（美国印第安纳州印第安纳波利斯）购买。修饰寡核苷酸和PCR引物由Macrogen（韩国大田）合成。Lachnospiraceae细菌 ND2006来源的双链DNA片段、crRNA和Cas12蛋白从Integrated DNA Technologies（美国爱荷华州科罗尔维尔）获得。本研究中使用的寡核苷酸序列，包括触发DNA，
利用Cas13a将16S rRNA识别转化为蛋白质输出
我们首先通过使用Cas13a的附带切割生成一个DNA触发剂来实现16S rRNA的蛋白质检测，该触发剂可以与部分单链表达盒结合。如先前报道（Park et al. 2024a），这样的表达盒可以在存在互补DNA触发剂时启动无细胞蛋白质合成。在这个表达盒中，包含T7启动子的5′区域是单链的，因此仅模板本身不足以
结论
我们提出了CRIVER，这是一种模块化的无细胞生物传感方案，它将核酸识别转化为可编程的蛋白质输出。通过将Cas13a对16S rRNA的识别与DNAtrigger–RNA–PSDNA前体的附带切割相结合，确保只有在目标激活时才生成具有延伸能力的DNA触发剂，从而实现属级检测。通过使用化学编程的报告基因实现位点选择性的Cas12a附带切割，达到种级分辨率，
CRediT作者贡献声明
宋东妍（Dong-Yeon Song）：可视化、形式分析、数据管理。朴允真（Yu Jin Park）：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、形式分析、数据管理、概念化。金东明（Dong-Myung Kim）：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。郑惠彬（Hye Bin Jeon）：可视化
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国防发展局（ADD）资助的具有挑战性的未来防御技术研究与发展计划（Challengeable Future Defense Technology Research and Development Program）的支持，该计划由国防采购计划管理局（Defense Acquisition Program Administration）在2021年提供资金（项目编号UI220005TD），同时也得到了韩国国家研究基金会（项目编号NRF-2020R1A2C2013114和RS-2024-00439931）的支持。
