树突状细胞通过DEC205结合溶瘤性呼肠孤病毒靶向CEA肿瘤抗原，在结直肠癌模型中激发了强烈的免疫反应

《Cellular Immunology》：Dendritic cells targeted CEA tumor antigen through DEC205 in combination with oncolytic reovirus stimulate strong immune response in colorectal cancer model

CEA靶向树突状细胞疫苗联合Reovirus病毒治疗及PD1/PD-L1抑制剂、来那度胺和坏死细胞胞质作为辅助剂显著抑制结直肠癌小鼠模型肿瘤生长并增强免疫应答，其中联合疗法效果最优，但不同辅助剂无显著差异。

　　

Nazila Hajiahmadi|Seyed Mohammad Moazzeni|Mathias Tenbuch|Somayeh Shatizadeh Malekshahi|Atefeh Yari|Taravat Bamdad

伊朗德黑兰塔比亚特莫达雷斯大学医学院病毒学系

摘要

背景

结直肠癌是全球最常见的癌症之一。目前的治疗方法，包括手术、化疗和放疗，由于其非特异性作用、药物耐药性以及无法诱导记忆性免疫反应而存在局限性。联合疗法似乎更为有效。本研究在鼠结直肠癌模型中探讨了针对CEA肿瘤抗原的免疫疗法与Reovirus病毒疗法的单独及联合抗肿瘤效果。方法：构建了一种表达CEA基因并融合DEC205的重组腺病毒，以靶向树突状细胞（DCs）。通过评估肿瘤生长、组织学变化和免疫反应，研究了免疫疗法与病毒疗法单独使用以及与PD1/PDL1抑制剂、来那度胺和CEA CT26坏死细胞联合使用的效果。同时也研究了CEA免疫的预防效果。

结果

在预处理条件下，靶向CEA的DCs与所有三种辅助剂共同作用时，显著抑制了肿瘤生长（p值<0.05），并增强了细胞免疫反应，相比未处理组有明显改善。在携带肿瘤的小鼠中，免疫疗法单独使用或与病毒疗法联合使用，并加入三种辅助剂后，其抗肿瘤效果均优于未处理组。

结论

靶向CEA的免疫疗法和免疫病毒疗法诱导了强烈的抗肿瘤免疫反应。综合所有测量参数来看，没有足够的证据支持任何单一辅助剂的优越性；然而，来那度胺在联合疗法中增强了特异性免疫和抗肿瘤效果。本研究中使用的所有联合方案均能诱导强烈的抗肿瘤免疫力，可以通过额外的辅助疗法进一步优化以实现完全肿瘤消退。

引言

结直肠癌（CRC）是全球最常见的癌症之一，发病率排名第三，但死亡率排名第二[1]。三种主要的传统癌症治疗方法——手术、化疗和放疗虽然有效，但存在一些局限性，如非特异性、对正常细胞有毒性、容易产生耐药性亚克隆以及无法建立持久的免疫力[2]、[3]。需要不断探索新的治疗方法来提高癌症治疗的安全性和有效性，以克服这些缺点。癌症免疫疗法是一种令人鼓舞的新方法，它通过激活免疫系统来对抗肿瘤。各种免疫疗法包括溶瘤病毒疗法（OVT）、检查点阻断、过继T细胞疗法等[2]。将免疫疗法与其他方法结合使用可以提高治疗效果、增强免疫反应、减少免疫抑制，并产生持久的抗癌免疫力[4]。Reovirus（RV）是一种双链良性RNA病毒，具有溶瘤特性，是治疗研究的领先候选者[5]。RV介导的癌细胞杀伤机制包括凋亡依赖性和非凋亡依赖性途径[6]。除了主要作用外，溶瘤病毒还能诱导免疫系统反应。肿瘤会创造一个免疫抑制环境，阻止免疫系统识别癌细胞。将溶瘤病毒递送到肿瘤中可以产生针对肿瘤抗原的强大而持久的免疫反应，并支持免疫记忆的形成。由于免疫系统将病毒视为病原体，因此伴随的抗病毒反应可能成为溶瘤病毒的有效屏障[2]。有证据表明，将溶瘤病毒疗法与其他癌症免疫疗法结合使用可以获得最佳的抗肿瘤效果[7]。目前，两种类型的癌症疫苗通常利用肿瘤相关抗原（TAAs）或肿瘤特异性抗原（TSAs）来激活患者的免疫系统。TAAs在癌细胞表面的分布比正常细胞更广[8]。T细胞识别由人类白细胞抗原（HLA）呈递的TAA衍生肽，从而引发针对癌症的免疫反应[9]。确定合适的TAAs并选择最佳辅助剂对于开发有效的疫苗至关重要[10]。癌胚抗原（CEA）是最早被发现的TAAs之一，在98.8%的CRC病例中表达[11]，并已在多项癌症治疗研究中得到应用[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。将抗原靶向树突状细胞（DC）特异性受体，并结合免疫刺激辅助剂，可以引发强烈的T细胞反应[17]。最常用的将抗原递送到DCs的分子是DEC-205，需要同时使用辅助剂来最佳地诱导抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和T辅助细胞[18]。本研究中，使用PD1/PDL1抑制剂来那度胺（L）和坏死癌细胞的裂解物作为辅助剂，以增强靶向CEA的免疫接种效果。越来越多的研究表明，阻断PD-1可以增强免疫系统对抗癌细胞的能力[19]、[20]。来那度胺是一种合成免疫调节药物，具有显著的抗肿瘤、抗血管生成和抗炎作用[21]、[22]。将来那度胺作为辅助剂与肿瘤抗原负载的DC疫苗联合使用，可显著抑制肿瘤生长并增强小鼠癌症模型中的抗肿瘤免疫力[23]、[24]。坏死癌细胞的裂解物含有多种蛋白质，可促进DC成熟并刺激CD4+和CD8+ T细胞，在肿瘤部位引发快速免疫反应[25]、[26]。

本研究在鼠模型中探讨了免疫疗法与溶瘤病毒疗法联合治疗CRC的效果。免疫疗法使用了表达CEA抗原的腺病毒载体，该载体靶向DC205，并结合了PD1/PDL1抑制剂来那度胺和坏死CEA表达CRC细胞的裂解物。

细胞培养和试剂

低传代人胚肾293（HEK293）细胞、L929细胞（小鼠成纤维细胞系）和CT26细胞（BALB/c结直肠癌细胞系）来自伊朗生物资源中心。这些细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，培养条件为5% CO2和37°C。小鼠脾细胞则在添加了10% FBS的RPMI 1640培养基中培养。

Reovirus

Reovirus是一种...

不同治疗组之间的肿瘤生长无统计学差异

在第二次免疫治疗后、进行病毒治疗之前以及小鼠处死当天，测量并记录了肿瘤大小。尽管不同治疗组的肿瘤生长存在差异，但各组之间的肿瘤大小无统计学差异（图1）。

免疫疗法和免疫病毒疗法组招募了更多的CD8⁺细胞到肿瘤部位，且差异显著

通过IHC染色检测了肿瘤组织中的FoxP3⁺和CD8⁺免疫细胞浸润情况，结果以FoxP3⁺/CD8⁺比率表示（图2）。统计分析显示...

讨论

本研究在鼠模型中探讨了免疫疗法与溶瘤病毒疗法联合治疗CRC的效果。Reovirus是治疗研究的领先候选者，目前已进入三期试验[5]，本研究也使用了该病毒。在一期人体试验中，使用CEA肽脉冲处理的DCs进行CRC免疫疗法显示该方法安全有效[13]、[31]。然而，这种方法成本较高且耗时较多。

结论针对DC的免疫疗法和免疫病毒疗法诱导了强烈的抗肿瘤反应。尽管没有足够的证据表明本研究中使用的任何一种辅助剂在所有测量参数上都优于其他辅助剂，但免疫疗法与来那度胺和Reovirus（Immuno+L?+?Reo）联合使用在治疗效果指数上表现出最强的效果（图4）。因此，虽然各辅助剂之间的总体差异不明显...

作者贡献

TB设计并监督了整个研究工作。NH负责所有实验、数据收集和统计分析。SSM撰写了手稿的初稿。TB、SSM和MT审阅了论文。所有作者都阅读并批准了最终版本的手稿。

CRediT作者贡献声明

Nazila Hajiahmadi：撰写——初稿、方法学、实验设计、数据分析。Seyed Mohammad Moazzeni：方法学。Mathias Tenbuch：方法学。Somayeh Shatizadeh Malekshahi：撰写——审稿与编辑、初稿撰写。Atefeh Yari：方法学、实验设计。Taravat Bamdad：撰写——审稿与编辑、资金筹集、数据分析、概念构思。

出版同意

不适用。

伦理批准和参与同意

动物实验遵循了塔比亚特莫达雷斯大学医学院实验室动物伦理委员会的指导方针。获得批准编号IR.MODARES.REC.1398.039后，本研究符合相关规则和规定。

资助

本研究作为博士论文的一部分进行，得到了塔比亚特莫达雷斯大学（Med.80052）医学院的资助，部分资金来自NIMAD（国家医学研究发展研究所（资助编号：957970）。本研究基于伊朗国家科学基金会（INSF）（项目编号：98013096）的支持。

利益冲突声明

我们声明本手稿为原创作品，此前未发表过，也未在其他地方考虑发表。不存在利益冲突。