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ErbB2/Nucleolin/H-Ras三基因协同激活肿瘤细胞信号通路促进恶性转化。通过免疫沉淀和邻近定位技术证实GTP结合型H-Ras（G12V）增强ErbB2与Nucleolin膜定位复合物形成，促进受体磷酸化及下游MAPK/PI3K-Akt信号传导，显著提升软琼脂克隆形成和迁移能力。该机制为靶向ErbB2/NCL/Ras通路提供新策略。
Gal Zysman | Adva Kochavi | Roni Haklai | Ronit Pinkas-Kramarski
特拉维夫大学神经生物学系，拉马特阿维夫 69978，以色列
摘要
ErbB受体的过表达、其信号传导组分的表达以及突变型Ras的活性是癌症发生的主要因素。突变型Ras可以影响ErbB受体的激活，而核仁蛋白核仁素（NCL）能够结合并激活ErbB受体。先前的研究还表明，活化的Ras可以增强核仁素与ErbB1受体之间的相互作用，这种相互作用会促进肿瘤细胞的生长。由于ErbB受体是重要的致癌基因，且ErbB2在许多类型的癌症中常常过表达，因此在本研究中我们探讨了ErbB2、Ras和核仁素基因之间的关联。通过细胞生物学和生物化学方法，我们发现H-Ras（12V）蛋白能够增强NCL与ErbB2之间的相互作用。这三种蛋白主要定位于细胞膜以及其他细胞内位置。利用邻近连接实验，我们证实H-Ras（12V）促进了ErbB2/NCL复合物的形成，这些复合物主要存在于细胞膜上，但也可能存在于细胞质和细胞核中。这三个致癌基因的相互作用增强了ErbB2的磷酸化以及ErbB2介导的下游信号通路（如Erk和Akt）。此外，这三种蛋白的表达还促进了肿瘤细胞的克隆形成、脱离基底膜的生长和迁移能力。因此，活化的Ras可以增强ErbB2和NCL的致癌效应。这些发现有助于开发治疗ErbB2/nucleolin和突变型Ras过表达肿瘤的新方法。
引言
ErbB受体酪氨酸激酶亚家族包含四个成员：ErbB1-ErbB4，它们与人类癌症的发生有关[1]。配体与ErbB受体结合后，会诱导受体二聚化、细胞内酪氨酸激酶的激活以及酪氨酸残基的自磷酸化，这些酪氨酸残基是信号转导分子的结合位点[2][3]。ErbB受体激活后激活的最显著信号通路之一是Ras/MAPK级联反应[4]。研究表明，无论是通过释放EGF样配体等生长因子[5][6]，还是以配体独立的方式[7]，持续激活的Ras都能诱导ErbB的磷酸化。此外，Ras信号通路在多种人类肿瘤（包括乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌）中都被证实是活跃的[8][9][10]，并且它是多种细胞外信号的交汇点。因此，Ras信号通路是一个很好的治疗干预靶点。ErbB受体及其配体的过表达也参与了多种人类癌症的发生，这使得它们成为越来越多抗癌药物的作用靶点[1][11][12][13]。在胶质瘤和非小细胞肺癌中，ErbB1发生扩增或突变；而在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤中，ErbB2则发生扩增或过表达。TCGA数据记录了多种人类癌症中ErbB2的扩增和过表达情况[14]。此外，7%的结直肠癌中存在ErbB2突变和扩增，这些改变可能表明肿瘤对EGFR抑制剂治疗具有抗性，有助于识别可以从ErbB2靶向治疗中获益的患者[15]。通过对TCGA研究网络中乳腺癌患者的临床和转录数据分析发现，核仁素（NCL）的过表达会影响ErbB2+乳腺癌患者的总体生存时间和疾病风险，说明这两种蛋白在体内具有协同作用[16][17]。
在之前的研究中，我们已经证明NCL可以与ErbB受体相互作用[16][17][18][19]，并且ErbB1/NCL可以与Ras癌蛋白相互作用[20]。这种相互作用导致受体在体外和体内（如胶质瘤、前列腺癌和结肠癌）中独立于配体而激活，并促进细胞转化[16][17][19][20][21][22][23]。其他研究还表明，核仁素这种核仁多功能蛋白在多种癌细胞的表面常常过表达[24]，抑制细胞表面的NCL可以显著减少肿瘤细胞的生长[25][26]。最近的研究发现，ErbB2/NCL的相互作用会触发受体激活并增加细胞的致瘤性[16]。使用特定的ErbB2激酶抑制剂可以抑制乳腺癌细胞的生长[17]。破坏ErbB-NCL相互作用可以在体外和体内抑制它们的致瘤效应[16][17][21][23]。
在本研究中，我们探讨了ErbB2、NCL和Ras在介导细胞转化过程中的相互作用。我们通过免疫沉淀和邻近连接实验验证了NCL、ErbB2和Ras蛋白之间的相互作用，并证实GTP结合的H-Ras能够增强ErbB2/NCL的相互作用。NCL的212C末端氨基酸足以实现这种相互作用，并且它们在细胞膜上与Ras共定位。三种蛋白的共同表达增强了向丝裂原活化蛋白激酶（MAPK；MEK/Erk）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）级联通路的信号传导。最后，我们发现活化的H-Ras（G12V）、NCL和ErbB2的表达能够促进细胞转化，这通过克隆形成实验和软琼脂培养实验得到了证实。
材料与缓冲液
人重组EGF购自Boehringer Mannheim公司。多克隆兔抗ErbB2抗体、单克隆鼠抗ErbB2抗体、鼠抗GFP（B-2）和鼠抗NCL（C23）购自Santa Cruz Biotechnology（美国加州）。兔抗NCL抗体购自Abcam（英国）。单克隆鼠抗pan-Ras（Ab-3）购自Calbiochem公司。多克隆兔抗磷酸化ErbB2、Erk和Akt抗体购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州）。
ErbB2、NCL和Ras相互作用的分析
NCL可以与四种ErbB受体相互作用，并增强EGF受体的激活和磷酸化[16][18]。此外，活化的Ras也能显著增强ErbB1/NCL的相互作用[16][20]。因此，我们研究了活化的Ras是否也会影响ErbB2/NCL的相互作用及其激活过程。我们使用了MDCK细胞（用于稳定的克隆分析）、HEK-293T细胞（具有高效的转染效率，可用于结构域定位）以及LNCaP前列腺癌细胞进行研究。
讨论
NCL是一种多功能磷酸蛋白，主要存在于核仁中，但也存在于其他细胞组分中，包括细胞膜[33]。NCL在细胞生长和存活中起着关键作用。先前的研究表明，NCL与K-Ras在核仁中相互作用[34]，并且NCL还能调节K-Ras与细胞膜的相互作用以及MAPK信号通路[35]。我们还描述了NCL与ErbB1受体在细胞膜上的相互作用。
结论
本研究探讨了ErbB2、NCL和H-Ras之间的相互作用及其促进细胞转化的能力。我们通过免疫沉淀和邻近连接实验证实了这三种蛋白（NCL、ErbB2和H-Ras）之间的相互作用。此外，我们还发现GTP结合的H-Ras能够增强ErbB2/NCL的相互作用，并且这三种致癌基因在细胞中共定位。它们的共同表达增强了下游信号通路的活性。最后，我们证实了……（原文此处内容不完整）
CRediT作者贡献声明
Gal Zysman：验证、方法学设计、实验实施、数据分析、数据整理、撰写及审稿编辑。
Adva Kochavi：方法学设计、实验实施、数据分析、撰写及审稿编辑。
Roni Haklai：项目管理、方法学设计、实验实施、撰写及审稿编辑。
Ronit Pinkas-Kramarski：项目监督、资源协调、项目管理、方法学设计、实验实施、资金筹集、数据整理、概念构思、撰写及审稿编辑。
资助
本研究得到了以色列癌症协会（资助编号：20201176）和Prajs-Drimmer抗退行性疾病药物开发研究所（RPK）的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
