环境中的乙酰氨基吡啶（Acetamiprid）浓度通过TLR4/MYD88/NF-κB信号通路与JAK-STAT信号通路之间的相互作用，诱导了斑马鱼幼体的先天免疫毒性

《Chemico-Biological Interactions》：Environmental concentrations of Acetamiprid exposure induced innate immunotoxicity in zebrafish larvae via crosstalk between the TLR4/MYD88/NF-κB and JAK-STAT signaling pathways

环境污染物吡虫啉（Ace）通过激活TLR4/NF-κB和JAK-STAT信号通路诱导斑马鱼免疫毒性，表现为免疫细胞表型异常、氧化应激增强及线粒体凋亡，TLR4抑制剂可有效缓解上述效应。

　　

李子旭|李丹|李晓|龚雅涵|冯薇薇|陈瑶|杨柳青|吴向阳|毛光华

江苏大学环境与安全工程学院，应急管理学院，中国镇江学府路301号，212013

摘要

乙酰氨基吡啶（Ace）是一种已知的有毒环境污染物。然而，其免疫毒性尚未得到充分研究。本研究利用斑马鱼探讨了其先天免疫毒性及其潜在机制。通过分子对接和热位移实验，初步证明了Ace可能对Toll样受体4（TLR4）具有激动作用。为进一步验证这一推测，本研究分析了在Ace作用下斑马鱼在个体、蛋白质和基因水平上的免疫毒性相关指标的变化。结果表明，Ace改变了免疫细胞的表型特征，增加了NADPH氧化酶的活性，引发了氧化应激，并触发了由线粒体途径介导的细胞凋亡。此外，它还显著改变了参与TLR4/MYD88/NF-κB和JAK-STAT信号通路的关键蛋白质和基因的表达。最后，添加TLR4抑制剂有效缓解了这些不良效应，突显了TLR4/MYD88/NF-κB信号通路及其与JAK-STAT通路之间的相互作用在Ace诱导的免疫毒性中的关键作用。总体而言，本研究揭示了环境浓度下的Ace引起免疫毒性的新机制，为评估Ace的生态和健康风险提供了重要见解。

引言

新烟碱类杀虫剂在全球范围内的广泛分布对环境健康构成了重大挑战，因为它们可能对非目标生物产生负面影响。作为第三代新烟碱类杀虫剂，乙酰氨基吡啶（Ace）因其低哺乳动物毒性、高效率和广谱杀虫活性而被广泛使用（Luo等人，2025；Phogat等人，2022）。然而，Ace的不合理使用及其高水溶性使其能够通过多种途径进入生态系统（Nisa等人，2025；Yehouenou等人，2025）。因此，现在在各种环境介质中经常检测到Ace的存在，带来了潜在的生态和健康风险。例如，全球水体中经常检测到Ace，其平均残留量在ng/L到μg/L之间（Araujo等人，2022；Borsuah等人，2020）。更令人担忧的是，这种广泛的环境分布正逐渐转化为对人类的直接暴露风险。事实上，在人类血液和尿液样本中经常检测到Ace的痕迹，这使得研究重点从环境生态学转向了公共卫生（Zhang和Lu，2022）。目前使用多种模式生物，包括体外细胞培养物、小鼠和斑马鱼，来评估Ace的安全性（Hu等人，2023；Lee等人，2025；Wu等人，2025）。传统的毒理学评估主要关注其神经毒性和内分泌干扰作用。然而，Ace的毒性远不止这些方面。初步的体外和体内研究表明，Ace可能对生物具有免疫毒性（Salih等人，2023；Arafa等人，2025）。鉴于免疫系统在维持体内平衡中的关键作用，其功能障碍通常会成为多系统毒性的“启动器”或“放大器”（Li等人，2024）。因此，研究Ace暴露对免疫系统健康的影响，特别是其免疫毒性的生物学过程和机制，对于全面评估其安全性至关重要。

研究外源性因素对机体免疫系统的潜在有害效应机制尤为重要，因为先天免疫系统是抵御病原体威胁或压力的第一道防线（Xiong等人，2019；Zhao等人，2024）。Toll样受体（TLRs）是先天免疫系统的关键哨兵，负责识别病原体相关分子模式（PAMPs）和化学刺激（Gerber-Tichet等人，2025；Jiang等人，2025）。TLRs由多种免疫细胞表达，包括巨噬细胞和中性粒细胞，并通过触发下游信号转导通路来启动炎症反应（Kawai和Akira，2010；O'Neill等人，2013）。与其他TLR家族成员不同，TLR4更容易被各种类型的配体激活（Xu等人，2021）。已有多种新烟碱类杀虫剂被证实对TLR4具有激动作用（Zhang等人，2023；Zhong等人，2020）。作为新烟碱类家族的主要成员，Ace是否也具有TLR4激动作用并通过该途径介导免疫毒性尚不清楚。

实际上，免疫反应是一个高度整合和网络化的过程。TLR4的激活仅是免疫反应的初始触发，而下游信号的有效转导对于放大和维持免疫反应至关重要（Tang等人，2023）。JAK-STAT信号通路（一种常见的细胞内信号转导通路）在进化过程中被炎症信号所选择。该通路在触发先天免疫反应、调节适应性免疫以及调控几乎所有免疫细胞的增殖、分化和功能方面起着关键作用（Cheng等人，2021）。因此，本研究以TLR4作为“上游”入口点，JAK-STAT通路作为“下游”效应通路，旨在系统地探讨Ace是否通过TLR4/JAK-STAT信号轴介导免疫毒性。

由于斑马鱼的免疫系统与人类非常相似，且体型小、光学透明度高、操作方便，非常适合进行成像研究，因此选择斑马鱼作为本研究的实验模型，以阐明环境相关浓度下Ace介导的免疫毒性的分子机制（Modarresi等人，2020；Ma等人，2025）。首先，通过分子对接（MD）模拟、热位移测定和转基因斑马鱼表型评估实验来确定TLR4是否是Ace介导免疫毒性的关键靶点。此外，通过荧光探针孵育、实时定量PCR和Western blot技术，在每个处理组中研究了活性氧（ROS）、吖啶橙（AO）、TLR4/MyD88/NF-κB和JAK-STAT信号通路中的关键基因和蛋白质，以及这些通路之间的相互作用。因此，本研究不仅为Ace的全面健康风险评估提供了重要的免疫学证据，还为环境污染物破坏免疫功能的普遍机制提供了新的见解。

化学物质

乙酰氨基吡啶（CAS: 135410-20-7，99.93%）、二甲基亚砜（DMSO）（CAS: 67-68-5，100%）、雷萨托维德（TAK-242）（10 mM × 1 mL溶于DMSO中）（CAS: 243984-11-4，99.95%）、吖啶橙（AO）（CAS: 65-61-2，99.86%）、2’,7’-二氯二氢荧光素二醋酸盐（DCFH-DA）（CAS: 4091-99-0，99.82%）和中性红（CAS: 553-24-2，染料含量≥90%）均从MedChemExpress（美国新泽西州）购买。此外，还购买了1-苯基-2-硫脲（PTU）（CAS: 103-85-5，98%）和甲醇（CAS: 67-56-1，用于高效液相色谱（HPLC）。

Ace暴露浓度的验证

为了验证暴露期间Ace浓度的稳定性，在多个时间点（0、24、48和72小时）收集水样，并通过HPLC测定每个处理组的实际浓度。如图1A所示，在0-5 mg/L范围内，Ace的浓度与其峰面积之间存在强烈的线性关系（R2 = 0.991），回收率介于81.3% ± 0.8%到93.8% ± 0.7%之间（图1B）

讨论

Ace已成为农药市场中增长最快、使用最广泛的杀虫剂之一。尽管它在害虫控制方面效果显著，但Ace对环境和非目标生物也存在重大风险（Khurana等人，2023）。除了众所周知的神经毒性和内分泌干扰作用外，Ace还被发现对免疫系统具有毒性作用。事实上，多项研究报道了Ace暴露对非目标生物的免疫毒性影响

结论

本研究首次揭示，环境相关浓度的Ace可以破坏斑马鱼的免疫功能。本研究通过先天免疫细胞数量的减少、功能的紊乱、抗氧化防御的抑制以及TLR4/NF-κB和JAK-STAT信号通路之间的相互作用介导的炎症反应来表征Ace诱导的免疫毒性。这些发现提供了新的

CRediT作者贡献声明

李子旭：写作 – 审稿与编辑，原始草稿撰写，软件使用，资源准备，方法论设计，实验实施，概念构思。李晓：实验实施。李丹：写作 – 审稿与编辑。冯薇薇：写作 – 审稿与编辑，实验实施。龚雅涵：实验实施。杨柳青：写作 – 审稿与编辑。陈瑶：写作 – 审稿与编辑。毛光华：监督，资金获取，概念构思。吴向阳：监督，资金获取，概念构思

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了江苏大学应急管理学院专项研究项目[KYC-10]、江苏大学本科创新培训项目[X2025102990519]、镇江药物疗效与健康风险评估重点实验室（SS2024006）、江苏省高等教育机构优先学术计划以及水处理技术与材料协同创新中心的支持。