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耐甲氧西林肠球菌生物膜通过pH梯度驱动的新型纳米复合材料实现协同光热-阳离子疗法，在pH6.5触发纳米颗粒聚集释放，温和光热（≤45℃）结合阳离子破坏细菌膜结构，体外清除率>90%，动物模型显示80% abscess shrinkage和3.1 log??细菌载量 reduction。
Fang Zhang|Jun He|Jiangshan Chen|Zhaoru Hou|Si Li|Tingting Jiang|Xiaorui Jiang
中国烟台鲁东大学生命科学学院
摘要
耐万古霉素的肠球菌（VRE）生物膜会形成一个动态的酸性微环境，其特征是从外层（约pH 6.5）到核心层（约pH 5.5）存在pH梯度。传统的pH触发策略由于激活阈值较低（pH ≤ 5.5）而无法有效应对这一梯度，导致生物膜清除不完全。因此，我们提出了一种新型纳米复合材料（NPs），其pH响应阈值提升至6.5，该材料通过静电组装将万古霉素偶联的碳点（CNDs@Van）和赖氨酸修饰的碳点（CNDs@Lys）结合而成。这些纳米颗粒能够在酸性生物膜微环境中按需组装并切换电荷。在生物膜边缘（pH约6.5）处，质子化诱导的聚集会引发低温光热疗法，在温和加热（≤45°C）条件下实现超过90%的生物膜清除率。当纳米颗粒迁移到更酸性的区域（pH降至5.5）时，会释放出阳离子型CNDs@Lys，这些颗粒能够穿透生物膜并导致约99.99%的细菌死亡。在鼠皮下感染模型中，NPs在近红外（NIR）照射下治疗2天后，脓肿缩小了约80%，细菌负荷减少了3.1个对数单位。阳离子膜破坏与温和光疗的协同作用能够在减少光照强度和曝光时间的同时，将非靶组织的热损伤降至最低。这一策略不仅扩展了pH激活范围，覆盖了更广泛的生物膜微环境，还通过pH梯度驱动的组装和电荷切换实现了时空可控的双模式治疗，为对抗耐药性生物膜提供了一个精确有效的平台。
引言
耐万古霉素的肠球菌（VRE）生物膜是一种由细胞外聚合物（EPS）形成的特殊结构[1]，[2]。它作为物理屏障，阻碍抗生素的渗透，使得药物难以到达细菌。此外，由于EPS的包裹作用，氧气无法进入生物膜，细菌被迫进行无氧糖酵解，形成弱酸性环境，这限制了抗生素在生物膜中的效果，从而促进了细菌的耐药性[3]，[4]，[5]，[6]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]。
光热疗法（PTT）利用光热剂将光转化为热能，使细菌蛋白质变性并破坏细胞壁，从而达到杀菌效果[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[17]，[18]，[19]。然而，这些光热剂（如贵金属纳米颗粒、碳纳米管等）产生的局部温度可能超过50°C，有可能对健康组织造成附带损伤。此外，它们在水中的溶解度较差，代谢清除速度较慢[20]。相比之下，阳离子纳米材料通过静电结合负电荷的细胞膜来杀死细菌，从而抑制膜生长并诱导细胞死亡。不过，它们仍存在靶向特异性不足和生物相容性有限的问题[21]，[22]，[23]。
碳纳米点（CNDs）是直径为1-10纳米的球形碳基颗粒[24]，[25]，[26]。其表面带有羟基和羧基等官能团[27]，[28]。CNDs具有良好的水溶性、易于功能修饰以及低生物毒性等优点[29]，[30]，[31]，[32]，[33]，[34]，[35]，[36]，[37]。更重要的是，通过共价或非共价相互作用的自组装显著提升了它们的光热转换性能[38]，[39]，[40]，[41]，[42]。例如，Bu等人通过在碳纳米点表面构建酐键实现了共价组装，在特定激发下光热转换效率提高了30%，并实现了有效的光热杀菌[42]。此外，我们之前的研究还表明，非共价组装的CNDs可以对VRE生物膜的弱酸性环境产生pH响应[43]。然而，生物膜内代谢物的扩散受限会导致明显的pH梯度[44]，[45]。现有的pH响应策略主要针对强酸性微环境（pH < 5.5），其较低的激活阈值无法识别外层pH值为6.0–7.5的生物膜区域。此外，弱酸性条件下形成的CND聚集体通常大于200纳米，空间阻碍限制了其深入渗透，大大降低了清除效率。为了完全消除VRE生物膜，光热疗法需要将温度升至50°C以上并持续5–10分钟，这不可避免地会对周围健康组织造成不可逆的损伤。因此，迫切需要创新策略：（1）将pH响应激活阈值提高到6.5，以覆盖更广泛的弱酸性生物膜微环境；（2）设计尺寸可调的纳米平台以实现深度渗透和局部递送；（3）引入多种杀菌机制（如光热-阳离子协同作用），以降低所需的光照强度和持续时间，从而避免对健康组织的伤害。
在这项工作中，我们开发了一种pH响应阈值提升至6.5的新型纳米复合材料（NPs），该材料能够在酸性生物膜微环境中按需组装并切换电荷，实现协同的光热-阳离子疗法。如图1a–b所示，这些纳米颗粒通过静电自组装将负电荷的万古霉素偶联碳点（CNDs@Van）和正电荷的赖氨酸修饰碳点（CNDs@Lys）结合而成。CNDs@Van上的万古霉素部分特异性地结合到VRE细胞壁上的D-Ala-D-Lac残基上，将纳米颗粒固定在生物膜表面。在生物膜外层（pH约6.5）处，CNDs@Van上的羧基质子化会降低其负电荷，使其接近等电点并引发初步聚集。这一过程不仅将激活pH值提高到6.5，从而广泛识别弱酸性生物膜边缘，还会释放出超小的阳离子型CNDs@Lys。当纳米颗粒进入更酸性的区域（pH < 6.5，甚至降至约5.5）时，进一步的质子化会减弱静电相互作用，促进CNDs@Lys的释放，并增强CNDs@Van组装成更大的、具有光热活性的聚集体。释放出的阳离子型CNDs@Lys深入生物膜，通过静电裂解破坏细菌膜，而聚集的CNDs@Van则有效将光转化为热能，实现局部高温效应。这种空间和pH梯度驱动的双模式作用相比单独使用光热疗法，显著降低了所需的光照强度和曝光时间，在温和条件下（≤45°C）实现了有效的生物膜清除，并最小化了组织损伤[46]，[47]。重要的是，超小的阳离子型CNDs@Lys在解决三个关键问题上发挥了关键作用：提高pH激活阈值、实现深度生物膜渗透以及提供多模式协同杀伤效果。因此，基于CNDs@Van/CNDs@Lys的纳米颗粒为通过按需组装和微环境响应的治疗方式提供了精准有效的耐药性生物膜治疗新范式。
碳纳米点（CNDs）的合成
称取10毫克无水柠檬酸，在180°C的油浴中加热3小时。所得黑色固体溶解在水中后，用分子量截断值为3500 Da的透析袋透析24小时。之后，将固体在180°C的油浴中加热直至水分蒸发，形成棕色固体，该固体被鉴定为CNDs[48]。
万古霉素修饰碳纳米点（CNDs@Van）的合成
CNDs@Van的制备采用了之前报道的方法[43]。取20毫克CNDs，与4毫升亚砜氯化物（SOCl2）混合
CNDs@Van和CNDs@Lys的合成与表征
CNDs是通过柠檬酸的无溶剂热解合成的，随后用硫酰氯对其表面羧基进行活化[48]。万古霉素（Van）通过酰胺键与活化的羧基共价结合，形成CNDs@Van。CNDs@Lys则是通过L-赖氨酸粉末的高温热解获得的。这两种碳纳米点均经过了进一步的表征：紫外-可见吸收光谱（图S1(a)）显示CNDs@Van和CNDs@Lys具有特定的吸收峰
结论
总结来说，我们开发了可根据需求自组装的纳米颗粒，这些颗粒由CNDs@Van和CNDs@Lys组成，能够特异性地针对VRE生物膜。在酸性生物膜微环境（pH ≤ 6.5）的刺激下，电荷转换驱动聚集并释放阳离子型CNDs@Lys，而CNDs@Van则组装成具有光热活性的结构。该双模式系统在温和加热（≤45°C）条件下实现了超过90%的生物膜清除率，流式细胞术证实细菌死亡率达到了41%
数据可用性声明
数据可向作者索取。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
CRediT作者贡献声明
Zhaoru Hou：撰写——原始草稿、验证、正式分析。Jiangshan Chen：撰写——原始草稿、验证、正式分析。Jun He：撰写——原始草稿、验证、研究、正式分析。Fang Zhang：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、正式分析、概念构思。Tingting Jiang：撰写——审稿与编辑、监督、研究、概念构思。Si Li：撰写——审稿与编辑。Xiaorui Jiang：撰写——审稿与编辑。利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢烟台自然科学基金-生物医学创新联合基金（ZR2025LQ011）和山东省自然科学基金（ZR2020MC079）的支持。
