《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：Sex-biased transcriptome dynamics during embryogenesis of the
Eriocheir sinensis
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中国毛蟹胚胎发育中性别差异的转录组与网络分析揭示"发育主导，性别渐显"的分子模式，鉴定19个共表达模块及关键性别调控因子，表明原肠胚阶段性别调控网络形成并伴随剪接体通路的性别特异性富集。
刘勇|邵书成|杨亚楠|倪梦琪|薛新茹|郑金斌|张毅|李奔驰|崔赵霞
宁波大学海洋科学学院，中国宁波 315020
摘要
Eriocheir sinensis的胚胎阶段对于建立早期性别分化信号至关重要，但其分子机制仍不清楚，部分原因是长期以来缺乏有效的胚胎性别鉴定技术。在本研究中，我们使用了一个仅在我们研究小组中可用的性别特异性分子标记来区分性别。随后，通过转录组测序结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）来比较三个胚胎阶段（囊胚、原肠胚和卵-无节幼体）的性别偏向基因表达。结果表明存在一种“以发育为主导、性别逐渐显现”的转录模式。WGCNA识别出19个共表达模块，在这些模块中基因表达主要在不同发育阶段存在差异。仅在囊胚阶段表现出明显的性别偏向，表现为绿色和浅黄色模块。结合差异表达基因（DEGs），发现与生殖系和繁殖相关的基因（VASA、WNT7、FTZ和GATA4）在雄性囊胚中上调。值得注意的是，重要的性别调节因子（Sxl、tra-2c、fem-1b、runt1a、FoxL2和Sox-14）表现出阶段依赖性表达，并在原肠胚阶段达到峰值，这一点得到了DEG分析和Mfuzz趋势聚类的支持。这种原肠胚阶段峰值模式伴随着剪接体和核质运输通路的富集。这表明胚胎发生过程中的性别差异可能在RNA/剪接水平上部分形成。这些发现揭示了E. sinensis胚胎阶段中发育程序和性别调节程序之间的联系，为甲壳动物性别分化提供了新的分子见解。
引言
性别决定和分化是甲壳动物发育生物学和水产遗传育种中的核心问题。性别在生长速率、能量分配和生殖投资方面的差异直接影响水产养殖产量和种群结构，因此需要在分子水平上进行剖析（Farhadi等人，2021；Li，2022）。最近的综述表明，十足类甲壳动物的性别分化并非由单一途径控制（Ventura，2025），而是由遗传性别决定（GSD）、激素/腺体信号（例如雄激素腺/AG轴）和环境因素共同作用的结果，其多样性大于脊椎动物，因此需要更细致的研究（Toyota等人，2021；Ye等人，2023）。
目前，关于甲壳动物性别决定和分化的分子机制的研究主要集中在模式物种或养殖物种上，如对虾、Macrobrachium虾和几种海洋蟹类，而针对胚胎的数据非常匮乏（Farhadi，2023；Wang等人，2024）。对于中华绒螯蟹Eriocheir sinensis，已经获得了染色体水平的基因组和多个组织和阶段的转录组数据，为阐明发育和性别调节过程提供了基础资源（Cui等人，2021；Yang等人，2023）。然而，现有的转录组数据主要来自成体或特定组织，并未形成一个涵盖胚胎发生的阶段性、性别分辨的框架。现有的胚胎转录组研究主要针对受精卵或分裂阶段，识别母源-合子转变（MZT）事件和发育必需基因，而不是在匹配的发育时间点比较性别偏向表达（Hui等人，2017；Du等人，2019）。最近的一项纳米孔长读长研究生成了雄性和雌性分裂阶段胚胎的全长转录组，但仅覆盖了一个时间点，因此无法解释胚胎发生过程中性别差异是如何逐渐出现的（Han等人，2024）。
此外，大多数关于E. sinensis的性别相关转录组研究都是在生殖腺、肝胰腺或应激响应组织的数据集中寻找女性或男性偏向基因。这些研究反映的是“性别特征已经确立”后的转录状态，无法推断出胚胎中性别信号最初何时开始（Liu等人，2015；Feng等人，2022）。因此，仅关注单个基因可能无法全面了解胚胎发生过程中的性别差异。性别相关信号可能分布在多个基因和通路中，并可能以协调的方式出现。因此，强调共表达模块和调节网络非常重要。加权基因共表达网络分析（WGCNA）是一种成熟的方法，可用于解析大规模转录组中发育阶段、基因集和功能过程之间的关系（Langfelder和Horvath，2008；Sánchez-Baizán等人，2022），并在动物发育和性状研究中有效识别关键模块和枢纽基因（Tao等人，2018）。
在此背景下，本研究首次系统地比较了E. sinensis三个关键胚胎阶段（囊胚、原肠胚和卵-无节幼体）的性别偏向转录组差异。我们构建了共表达网络，以识别与发育阶段和性别相关的模块和枢纽基因，从而超越了单基因差异分析，从网络和系统层面审视调节机制。这项工作填补了甲壳动物胚胎发生过程中性别偏向表达研究的空白，并从综合发育和性别的角度提供了性别分化机制启动的新分子证据。
样本收集和RNA提取
从江苏省盐城市收集了具有产卵能力的E. sinensis雌性个体（n = 31）。将胚胎置于不含RNase的培养皿中，其中含有Gibco溶液，并在18°C下使用注射显微镜（OLYMPUS，日本）根据已发表的E. sinensis形态分期标准确定其发育阶段（黄晓荣等人，2011；Cui等人，2025）。本研究中使用的每个阶段的代表性胚胎形态如图S1所示。
测序数据概述
对三个发育阶段（囊胚、原肠胚和卵-无节幼体）的转录组进行测序，共获得7.3819亿个原始读段，相当于约110.0 Gb。经过适配器和质量修剪后，保留了6.8249亿个干净读段，约101.7 Gb，用于后续分析。这些干净读段成功比对到参考基因组，平均映射率为88.07%，范围从84.01%到93.72%，详见表S2。
讨论
基于DEGs，在囊胚阶段发现的男性偏向基因包括几个经常在生殖系或性别相关背景下讨论的候选基因（例如VASA、WNT家族基因、FTZ和GATA家族因子）。Vasa是一种保守的生殖系相关DEAD-box解旋酶，已被广泛用作生殖系标记。在E. sinensis中，Es-vasa在生殖腺发育过程中表现出生殖腺特异性表达和阶段依赖性动态，支持其作为生殖系分子标记的使用（Wang等人，
结论
通过高通量转录组测序和加权基因共表达网络分析（WGCNA），本研究系统地揭示了Eriocheir sinensis胚胎发生过程中的发育进展和性别分化特征（囊胚、原肠胚和卵-无节幼体）。结果支持一种“以发育为主导、性别逐渐显现”的转录模式。
尽管雌性和雄性在核心代谢和转录功能上具有相似的富集特征
CRediT作者贡献声明
刘勇：写作 – 审稿与编辑、撰写原始草稿、可视化、验证、软件、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。邵书成：验证、软件。杨亚楠：监督、资源提供。倪梦琪：资源提供。薛新茹：资源提供。郑金斌：资源提供。张毅：资源提供。李奔驰：资源提供。崔赵霞：监督、资源提供、项目管理、资金获取、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（32072964）、****和CPSF博士后奖学金计划（GZC20252060）的支持。
