《Current Research in Microbial Sciences》：Specific role of two NlpC/P60 endopeptidases in cell division and membrane vesicle formation in
Deinococcus radiodurans
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本研究聚焦于极端耐辐射菌Deinococcus radiodurans的细胞壁重塑机制，通过解析三种NlpC/P60内肽酶（CwlA、CwlB、CwlC）的功能特异性，发现CwlB调控隔膜降解介导细胞分裂，而CwlA缺失会诱发膜囊泡（MVs）形成并与基因毒性应激通路（DdrO-IrrE）交叉对话，为细菌应激响应与细胞壁稳态的关联提供了新视角。
在微生物的世界里，有一种被称为"地球最顽强细菌"的奇迹生物——耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）。这种微生物能够在足以杀死绝大多数生物的强辐射、极端干燥和化学毒性环境中存活，甚至在国际空间站外太空环境中也能存活三年。其超强抵抗力的秘密，不仅在于高效的DNA修复机制，还与其独特的细胞结构密切相关。
耐辐射奇球菌虽然被归类为革兰氏阳性菌，但其细胞膜结构却呈现出革兰氏阴性菌的特征，在两膜之间拥有一层异常厚的肽聚糖（PG）细胞壁。这种复杂的细胞被膜结构是其抵抗外界胁迫的重要屏障。然而，维持这一屏障的动态平衡需要精细的调控，特别是在细胞生长和分裂过程中，肽聚糖的合成与水解必须保持精确的平衡。
在细菌细胞壁重塑过程中，有一类关键的酶——NlpC/P60内肽酶超家族，它们能够水解肽聚糖中的肽键，参与细胞生长、分裂和应激响应。耐辐射奇球菌基因组编码三种这样的内肽酶：CwlA、CwlB和CwlC。尽管这些酶在结构上相似，但它们在该极端环境适应型细菌中的具体功能分工却一直是个未解之谜。
为了解决这一问题，来自法国巴黎-萨克雷大学的研究团队在《Current Research in Microbial Sciences》上发表了他们的最新研究成果。研究人员通过系统的基因功能分析，揭示了这三种内肽酶在耐辐射奇球菌生命活动中的独特作用，特别是发现了它们与细菌应激响应通路之间的意外联系。
研究团队采用了多种关键技术方法：利用条件性基因敲除系统验证基因必需性；通过荧光显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态和膜囊泡形成；构建荧光蛋白融合标签进行蛋白亚细胞定位；以及基于RNA-seq的转录组分析基因表达调控网络。
3.1. 耐辐射奇球菌中内肽酶NlpC/P60的序列分析
研究人员首先通过生物信息学分析发现，CwlA和CwlB含有信号肽和LysM结构域，提示它们可能定位于细胞周质空间并结合肽聚糖，而CwlC含有SH3样结构域但缺乏信号肽。所有三种蛋白都具有保守的NlpC/P60催化结构域，包含特征性的半胱氨酸-组氨酸-天冬酰胺催化三联体。
3.2. cwlA是细胞存活所必需的基因
通过基因敲除实验，研究人员发现cwlB和cwlC基因可以被成功删除，但无法获得纯合的cwlA缺失突变体，表明cwlA是耐辐射奇球菌的必需基因。利用温度敏感型质粒的条件性敲除系统进一步证实，CwlA蛋白的耗竭会导致细胞死亡。
3.3. CwlB参与隔膜降解
形态学分析显示，ΔcwlB突变体在静止期表现出严重的细胞分裂缺陷，形成大量的双四联体（8个细胞）和四倍四联体（16个细胞），而野生型主要以二联体和四联体为主。这种表型在cwlB基因回补后得到恢复，表明CwlB在细胞分裂过程中负责隔膜肽聚糖的降解。
3.4. CwlA耗竭条件下的膜囊泡形成
当CwlA被条件性耗竭时，细胞不仅失去活力，还出现形态学改变并产生大量膜囊泡（MVs）。透射电镜观察证实了这些囊泡的存在，它们以球形结构从细胞表面出芽形成。
3.5. mitomycin C诱导DNA损伤后耐辐射奇球菌的膜囊泡形成
研究人员发现，用亚致死剂量的mitomycin C（一种DNA损伤剂）处理野生型细胞，同样会诱导膜囊泡的形成。类似的现象也在DdrO蛋白（耐辐射奇球菌主要基因毒性应激响应的转录抑制因子）耗竭的细胞中观察到。
3.6. DdrO耗竭条件下CwlA受到抑制
转录组分析显示，在DdrO耗竭16小时后，cwlA基因的表达被强烈抑制（约18倍），而cwlB和cwlC的表达没有显著变化。由于cwlA启动子区域没有发现DdrO结合位点，这种调控可能是间接的。
研究结论表明，CwlB主要参与细胞分裂过程中的隔膜降解，而CwlA则在维持细胞壁稳态中发挥基础性作用。特别重要的是，研究发现CwlA的缺失会触发膜囊泡的形成，这种现象与细菌在基因毒性应激（如mitomycin C处理）下的反应相似。DdrO耗竭导致cwlA表达下调，提示在基因毒性应激条件下，细菌通过调控细胞壁重塑酶的表达来协调应激响应与细胞被膜完整性维持。
这项研究的重要意义在于首次揭示了耐辐射奇球菌中NlpC/P60内肽酶的功能特异性，并建立了细胞壁重塑与基因毒性应激响应之间的分子联系。这不仅深化了我们对极端微生物适应机制的理解，也为研究细菌膜囊泡的生物发生及其在应激响应中的作用提供了新视角。膜囊泡作为细菌通讯和应激保护的重要媒介，其形成机制的解析对于理解微生物的环境适应性和潜在生物技术应用具有重要价值。
