《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Critical evaluation of enzymatic extraction for quantification of europium-doped polystyrene nanoplastics in tomato tissues by single particle ICP-MS
编辑推荐：
本研究针对农业环境中纳米塑料( NPs )的生物累积问题，开发了一种结合酶提取与单颗粒ICP-MS ( spICP-MS )的分析方法，用于定量番茄组织中铕掺杂聚苯乙烯纳米塑料( Eu-PS-NPs )。研究优化了提取参数，发现组织特异性显著影响回收率，暴露样本中Eu主要以离子形式存在( 最高达97% )，表明纳米塑料在植物体内存在严重金属浸出。该研究强调了在解释植物暴露研究中spICP-MS数据时，需考虑基质效应、金属浸出以及从加标对照到暴露样本回收率外推的局限性，为准确评估纳米塑料的植物吸收与累积提供了关键方法学见解。
随着全球塑料产量的持续增长，农业环境中的微塑料和纳米塑料污染已成为一个日益严峻的全球性问题。这些微小的塑料颗粒不仅长期存在于土壤中，更令人担忧的是，它们可能被农作物吸收并进入食物链，最终威胁人类健康。在各类塑料颗粒中，纳米塑料因其尺寸极小、更容易被植物吸收而具有更高的生态风险。然而，由于纳米塑料的尺寸微小、成分复杂且在植物基质中难以分离，准确检测和定量植物组织中的纳米塑料一直是一项巨大的分析挑战。传统的检测方法，如显微镜观察或常规的质谱分析，往往难以提供纳米塑料的颗粒数量、尺寸分布等关键信息。因此，开发一种能够精确量化植物体内纳米塑料的高灵敏度、高特异性分析方法，对于评估其环境行为和生态风险至关重要。
为了应对这一挑战，研究人员将目光投向了单颗粒电感耦合等离子体质谱技术。spICP-MS是一种强大的分析工具，能够对单个纳米颗粒进行计数，并提供其尺寸和质量浓度信息。然而，将spICP-MS应用于复杂的植物样本并非易事。首先，需要将纳米塑料从坚韧的植物组织中有效且完整地提取出来，同时不能破坏其物理化学性质。酶提取法被认为是一种温和且有望实现这一目标的方法，但其提取效率受多种因素影响，且在不同植物组织间可能存在显著差异。此外，为了增强spICP-MS的检测信号，研究中常使用金属标记的纳米塑料，例如本研究采用的铕掺杂聚苯乙烯纳米塑料。但金属标记物在植物体内复杂的环境（如酸性条件）中是否稳定、是否会从塑料颗粒上浸出，进而导致检测信号失真，这些都是亟待厘清的关键问题。本研究旨在系统评估酶提取法结合spICP-MS用于定量番茄植株不同组织（根、茎、叶、果实）中Eu-PS-NPs的可行性，并深入探讨影响提取效率的关键因素以及金属标记物在真实暴露场景下的稳定性。
本研究主要采用了以下关键技术方法：1） 使用水培法培养番茄植株（Solanum lycopersicum L. cv. Rally），并对其进行Eu-PS-NPs暴露实验，收集根、茎、叶、果实样本；2） 利用扫描电子显微镜和动态光散射技术对Eu-PS-NPs进行表征；3） 系统优化酶提取（使用Macerozyme R-10酶）的关键参数，包括缓冲液pH值、消化温度、消化时间、酶浓度以及消化后处理步骤；4） 采用单颗粒ICP-MS对提取液中的Eu-PS-NPs进行颗粒数量浓度、质量浓度、粒径及质量的分析，并区分纳米颗粒态铕和离子态铕；5） 通过微波辅助消解结合常规ICP-MS测定番茄组织中的总铕质量浓度，以计算提取回收率。
3.1. Eu-PS-NPs的表征
研究人员首先对所使用的Eu-PS-NPs进行了详细表征。spICP-MS分析结果显示，其颗粒数量浓度、质量浓度、中位粒径和中位颗粒质量的回收率均在88.1%至97.1%之间，与制造商提供的数据吻合良好，表明spICP-MS方法能够可靠地用于Eu-PS-NPs的定量和尺寸分析。动态光散射分析表明，纳米颗粒在去离子水中具有较高的稳定性（Zeta电位为-47.1 mV）。然而，在柠檬酸盐缓冲液中，随着pH值降低（从6.41降至4.53），纳米颗粒的Zeta电位负值减小，流体动力学直径增大，表明其在酸性条件下更容易发生聚集。
3.2. 利用加标番茄样品优化酶提取参数
本研究系统地评估了各种提取条件对Eu-PS-NPs回收率的影响。
- •
3.2.1. 柠檬酸盐缓冲液pH值和消化温度的优化：结果表明，在pH 6.5、37°C的条件下孵育24小时，能获得最高的颗粒回收率（>91%），而更低的pH值会导致回收率下降，这与其在酸性条件下稳定性降低、易于聚集有关。
- •
3.2.2. 消化后阶段的优化：比较了静置和不同转速/时间的离心效果，发现1000或2000 rpm离心3-5分钟与静置30分钟的效果相当，对颗粒尺寸无显著影响。因此，后续实验采用静置30分钟的处理方式。
- •
3.2.3. 消化时间和酶浓度的优化：这是一个关键发现，即最优提取条件具有显著的组织特异性。对于加标的根组织，延长消化时间至36小时能提高回收率；而对于茎、叶和果实组织，延长消化时间反而导致回收率显著下降。例如，在叶片中，36小时消化后的颗粒数量浓度回收率降至26.5%，远低于24小时消化的66.7%。研究人员推测，这可能是由于番茄茎叶组织中富含的多酚类物质在消化过程中释放，与纳米颗粒发生相互作用，导致其絮凝沉降。此外，果实组织由于其天然的酸性环境，延长消化时间也加剧了纳米颗粒的不稳定性和Eu的浸出。
- •
3.2.4. 干燥温度对提取效率的影响：研究发现，番茄样本在分析前经历的60°C干燥48小时的处理，会对Eu-PS-NPs的形貌造成影响（SEM显示颗粒出现熔融和聚集迹象），并导致所有组织中颗粒回收率的显著损失（根组织损失约65%，茎组织损失约27%）。因此，在计算暴露样本的回收率时，必须引入校正因子来补偿这一损失。
3.3. 酶提取参数对暴露番茄样品中Eu-PS-NPs分析效果的评估
这是本研究最具警示意义的发现。当将优化后的方法应用于在生长过程中真实暴露于Eu-PS-NPs的番茄样本时，结果与加标样本存在巨大差异。
- •
3.3.1. 消化时间和酶浓度对提取效率的影响：暴露样本的总铕质量提取回收率远低于加标样本。根和茎组织的回收率仅为18-32%，叶片回收率在多数条件下≤21%。尽管果实样本表现出较高的表观回收率（66-80%），但这很可能是酸性环境导致Eu从NPs中大量浸出所致。最关键的是，spICP-MS分析揭示，在暴露样本的提取液中，铕绝大多数以离子形式存在。例如，在果实中，离子态Eu的比例高达97%，这意味着仅有极少部分的Eu仍与完整的纳米颗粒相关联。这表明，在真实的植物暴露过程中，Eu-PS-NPs内部的铕螯合物已经发生了严重的浸出。
- •
3.3.2. 消化后pH调节对提取效率的影响：尝试在消化后调节提取液pH至中性，以及对某些组织在更低的缓冲液pH（4.5，即酶的最适pH）下进行消化，均未能显著改善Eu-PS-NPs的提取回收率。
本研究对理解金属标记纳米塑料在植物体内的分析挑战提供了深刻见解。主要结论是，酶提取结合spICP-MS的方法在用于加标对照样本时，可以取得良好的回收率，并能提供颗粒水平的信息。然而，该方法在应用于真实暴露样本时面临严峻挑战：一是提取效率低，表明酶消化可能不足以完全释放嵌入植物组织内部的纳米颗粒；二是金属标记物（本研究中的铕）在植物体内（尤其是在酸性组织如果实中）会发生严重浸出，导致spICP-MS检测到的信号主要来自游离的金属离子，而非完整的纳米塑料颗粒。这意味着，基于加标样本获得的回收率不能直接外推用于评估暴露样本中的纳米塑料含量，并且当前这种铕标记的纳米塑料不适合作为长期植物暴露研究的定量示踪剂。
其重要意义在于强调了对纳米塑料植物累积进行准确定量所必需的方法学考量。未来研究需要致力于开发更稳定的纳米塑料标记策略（例如核壳结构），并探索更有效的组织消化方法（如碱性消化或复合酶系）。同时，该研究也提示，在解释基于金属标记的spICP-MS数据时，必须谨慎评估基质效应和金属浸出行为，并需要结合聚合物特异性分析技术（如热裂解气相色谱-质谱法）来交叉验证纳米塑料本身的归趋。这项工作为建立可靠的分析方案以评估纳米塑料的农业环境和食品安全风险奠定了重要基础。
