《Fish & Shellfish Immunology》：Expression dynamics of sex-biased development- and immune-related genes are associated with early gonadal differentiation in grass carp
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通过转录组测序分析草 carp（Ctenopharyngodon idella）性腺在30-180天发育过程中免疫相关基因的动态表达，发现分子性别决定始于30天，形态分化分别于60（卵巢）和120天（睾丸）启动。性别特异性差异表达基因包括cyp19a1a（雌性）、dmrt1（雄性）及免疫信号通路关键基因，如IL-6和TNF-α在雌性中上调，IFN-I在雄性中显著激活。蛋白互作网络揭示卵巢和睾丸发育调控模块存在分化，雄性免疫网络整合更多发育相关调控因子。本研究为揭示两栖动物性腺发育中免疫-生殖互作机制提供了新证据。
张蕾|李泽宇|李帅|孟园|杨欣怡|李玉清|徐振|孙玉英|黄宇
河北大学生命科学学院/生物相互作用河北基础科学中心，中国保定071002
摘要
免疫-生殖相互作用在脊椎动物性腺发育中起着重要的调节作用。然而，免疫因子对硬骨鱼类早期性腺发育的贡献仍知之甚少。为了解决这一问题，我们对代表性硬骨鱼类——草鱼的雄性和雌性性腺在六个发育时间点进行了转录组分析，重点关注性别偏向的发育和与免疫相关的基因。我们的研究结果表明，草鱼的分子性别决定始于受精后约30天（dpf），随后卵巢和睾丸的形态分化分别发生在大约60天和120天。差异表达基因（DEGs）的时间序列分析揭示了与早期性腺分化相关的动态转录变化，识别出主要与雌性（例如：cyp19a1a、foxl2a/b）和雄性（例如：dmrt1、amh）发育相关的基因。有趣的是，在早期性腺发育过程中，与免疫相关的基因表达也表现出显著的性别差异。具体来说，雌性表现出早期巨噬细胞相关信号（第1阶段）和晚期微环境调节（第4阶段）的激活，而雄性则表现出延迟的巨噬细胞相关信号（第2阶段），随后是I型干扰素（IFN）信号的强烈诱导（第3阶段）。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析进一步突显了调节结构的分化，表明卵巢中的核心基因仅与性别发育相关（例如：ccna1、fancd2），而睾丸网络则整合了性别发育和免疫相关调节因子（例如：amh、isg15）。总体而言，我们的发现描述了发育和免疫程序的动态和性别特异性协调，为硬骨鱼类的性腺发育提供了新的见解。
引言
脊椎动物的性腺发育表现出明显的性别差异[1]，这是一个复杂的、严格调控的生物过程，对维持遗传多样性和物种长期生存至关重要[2]、[3]。这一过程通常包括两个阶段：性别决定和性别分化。前者确定了性别的命运，而后者则驱动未分化的性腺在结构和功能上向睾丸或卵巢转变[4]。传统上，性别发育主要受一系列参与性腺发育的关键基因的调控[5]、[6]。然而，越来越多的证据表明生殖和免疫之间存在广泛的相互作用[7]、[8]，免疫细胞积极参与这一过程，并成为性别差异形态发生的重要驱动因素[9]。因此，系统地描述性腺发育相关基因和免疫相关基因的时间动态，特别是在性别决定和性别分化的关键阶段，对于阐明性别发育的分子机制至关重要。
在鱼类中，性别决定和分化是高度复杂的过程，由关键性别决定基因（SDGs）的表达启动，随后是一系列分化相关基因（DRGs）的协调激活，这些基因指导性腺发育，最终将最初未分化的性腺导向睾丸或卵巢的命运[10]、[11]。鱼类具有多种性别决定机制，包括遗传性别决定（GSD）、环境性别决定（ESD）以及两者的混合模式[12]。迄今为止，已经鉴定出多种经典的SDGs，其中dmy、gsdf、sox3、amhy和sdy是硬骨鱼类中的典型例子[13]。在性别分化过程中，卵巢发育依赖于cyp19a1a和foxl2等基因，而睾丸分化则由dmrt1、gsdf、amh和sox9等基因驱动[14]、[15]、[16]。
随着研究的进展，人们逐渐认识到，除了经典的性别决定和分化基因外，免疫系统也参与性腺发育。通过与生殖系统的动态相互作用，它有助于建立生殖-免疫微环境[8]、[17]。这一概念在哺乳动物中已经得到了很好的证实。具体来说，睾丸的免疫微环境由免疫细胞（主要是巨噬细胞）、体细胞（包括支持细胞和间质细胞）、它们分泌的免疫调节因子以及由支持细胞形成的血-睾屏障（BTB）组成，共同构成了一个免疫特权环境[18]。其稳态依赖于TGF-β、IL-10和PD-1/PD-L1等免疫抑制信号[19]，从而防止免疫系统攻击免疫原性生殖细胞[18]。相比之下，卵巢在排卵期间表现出“生理炎症”的特征[20]、[21]，其特征是大量免疫细胞（包括中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞）的浸润[7]、[22]、[23]。这些免疫细胞在卵泡发生、组织重塑、黄体形成和黄体溶解中起着关键作用[17]、[22]，并释放IL-6、TNF-α、IL-8和MMP9等促炎细胞因子以促进排卵过程[22]。此外，性激素通过免疫细胞上的激素受体调节免疫细胞活性[24]，而巨噬细胞则通过产生25-羟基胆固醇来影响Sertoli细胞中的类固醇生成[25]、[26]。这些相互作用为生殖系统和免疫系统之间的双向调节提供了有力证据。
与哺乳动物类似，越来越多的研究表明，鱼类的免疫系统也参与性腺发育[27]，突显了生殖-免疫相互作用[28]、[29]。例如，在斑马鱼和欧洲海鲈中，免疫因子分别在性别决定和睾丸发育中起着关键作用[30]、[31]，因为它们可以通过Tp53介导的生殖细胞凋亡驱动性别反转，在欧洲海鲈中则有助于保护生殖组织。同时，鱼类性腺的局部免疫微环境受到内分泌信号的调节。例如，在红鲷鱼中，性激素可以诱导酸ophilic粒细胞和IgM+ B细胞浸润到睾丸中[32]。在斑马鱼中，与免疫相关的基因il1β和casp9在卵巢和睾丸之间的DNA甲基化表现出显著的性别差异[28]。这些发现表明，免疫基因不仅参与性腺发育，还可能表现出性别特异性的表达模式。
草鱼（Ctenopharyngodon idella）是中国“四大淡水鱼”之一，以其生长迅速、肉质优良和适应性强而闻名。2024年，其产量达到了616.49万吨，占中国淡水鱼总产量的21.69%，使其成为该国最重要的商业鱼类之一[33]。然而，草鱼的性腺发育周期较长，这使其性别控制和繁殖效率成为育种和生产中的主要瓶颈。迄今为止，关于草鱼性别相关机制的研究仅限于有限的基因集[34]、[35]，对早期性腺发育期间发育相关基因和免疫相关基因表达的时间动态的系统分析仍然缺乏。这一知识空白严重限制了种质改良和高效育种。因此，本研究结合了组织学检查与多时间点（30-180 dpf）的转录组测序，以描述草鱼早期性腺发育的连续阶段，并探讨了早期性腺发生过程中发育相关基因和免疫相关基因之间的协同调控机制。
实验动物
本研究中使用的所有草鱼均来自我们实验室建立的一个大型随机交配群体，该群体由60条雌鱼和60条雄鱼组成（2024年5月孵化）。亲本鱼苗来自长江、珠江和黑龙江流域附近的种质资源中心，确保了后代群体的广泛遗传多样性。鱼苗在关桥的室外池塘中饲养
雌性和雄性性腺的发育组织学检查及转录组测序
为了研究早期性腺发育，我们在不同的发育阶段进行了组织学检查。在30 dpf时，两性的性腺均为棒状，悬挂在体腔中，并通过短柄附着在腹膜上（图1A）。在这个阶段没有观察到形态上的性别差异，性腺被归类为第一阶段（形态未分化）。到60 dpf时，性别差异变得明显，标志着第二阶段的开始。在雌性中，这是
讨论
脊椎动物的免疫系统和生殖系统紧密相互作用，在性腺发育过程中发挥重要的调节作用。作为主要的脊椎动物谱系，鱼类也表现出受免疫信号影响的生殖过程[43]、[44]。然而，对于免疫因子如何促进硬骨鱼类早期性腺发育的系统理解仍然不足。这一知识空白在草鱼中尤为明显，因为其发育轨迹和潜力
CRediT作者贡献声明
徐振：概念构思、监督、资金获取。黄宇：监督、资金获取、写作 - 审稿和编辑。孙玉英：概念构思、监督。张蕾：实验设计、数据分析、数据可视化、初稿写作。李泽宇：样本采集、手稿修订。孟园：样本采集、组织切片。李帅：手稿修订。杨欣怡：样本采集。李玉清：样本采集。
数据可用性
本研究中使用的RNA-seq数据集已存放在NCBI Sequence Read Archive中，BioProject访问号为PRJNA1397497。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32503238、32225050、U24A20461）、湖北省自然科学基金（2024AFB508）和武汉市自然科学基金（2024040701010071）的支持。特别感谢中国科学院水生生物学研究所的罗洪瑞博士在整个研究过程中在鱼类采样和组织学样本制备方面提供的宝贵帮助。
