Aquaporin3在渗透调节、肠道稳态及抗病毒防御中的功能作用——以太平洋白虾（Litopenaeus vannamei）为例

《Fish & Shellfish Immunology》：Functional role of aquaporin3 in osmoregulation, intestinal homeostasis, and antiviral defense in Pacific white shrimp ( Litopenaeus vannamei)

本研究以石斑虾（Litopenaeus vannamei）为模型，通过RNA干扰技术敲低其肠道特异性水通道蛋白3（LvAQP3），系统探讨其在渗透调节、肠道稳态维持及抗病毒防御中的作用。实验表明，LvAQP3沉默显著降低虾血清渗透压和离子浓度，诱导肠道组织病理损伤，导致肠道菌群多样性下降（Vibrio属丰度升高），并加剧高盐胁迫下的死亡率（36.7%）和抗白斑综合征病毒（WSSV）能力下降。首次揭示了水通道蛋白3在虾类肠道中通过调控离子转运和菌群平衡实现盐胁迫适应的分子机制。

　　

王中凯|王北北|赵坤鹏|韩万宇|刘培良|宋轩|刁傲|陈云星|刘文娟|李玉泉

青岛农业大学海洋科学与工程学院，中国青岛266109

摘要

水通道蛋白（AQPs）是重要的膜蛋白，能够促进跨膜水分运输，在渗透调节和多种生理过程中发挥关键作用。在甲壳类动物中，AQPs对于适应盐度变化尤为重要。Litopenaeus vannamei是一种广盐性甲壳类动物，是研究盐度适应机制的理想模型。本研究探讨了LvAQP3在L. vannamei的渗透调节、肠道稳态和抗病毒防御中的作用。通过RNA干扰技术，我们抑制了LvAQP3的表达，并评估了其对盐度胁迫、肠道稳态以及白斑综合征病毒（WSSV）感染的生理反应。LvAQP3的敲低导致血淋巴渗透压和离子浓度下降，关键离子转运基因（包括LvNKAα、LvCAc和LvVHA）的表达显著改变，并在高盐度胁迫下增加了死亡率。长期抑制LvAQP3会损害肠道黏膜组织，转录组分析显示免疫相关基因表达发生显著变化，表现为prophenoloxidase-activating factor、alpha-2-macroglobulin和CD109的上调，以及cactus的下调。高通量16S rRNA测序显示细菌多样性降低，肠道微生物群组成改变，Vibrio数量显著增加。此外，LvAQP3缺乏的虾对WSSV的敏感性增强。这些发现强调了LvAQP3在调节L. vannamei的渗透调节和维持肠道稳态中的关键作用，从而影响其对病原体的抵抗力。

引言

太平洋白虾Litopenaeus vannamei是全球最重要的水产养殖物种之一，占全球虾产量的86%[1]。其生长速度快、抗病性强且饲料转化效率高，非常适合集约化养殖。此外，作为一种广盐性甲壳类动物，L. vannamei能在广泛的盐度范围内生存，因此可以在沿海到内陆地区进行养殖[2]。值得注意的是，L. vannamei的养殖在中国北部高盐度海域迅速发展，那里的盐度超过40[3]。因此，L. vannamei是研究盐度变化分子和生理反应的理想模型，其在不同盐度条件下的养殖具有重要的实际意义。

为了应对盐度变化，甲壳类动物精确调节其内部和外部液体以维持正常的生理功能和血淋巴渗透压/离子平衡。例如，Lvannamei的血淋巴渗透压会随发育阶段和环境盐度的不同而变化[4]。渗透调节基因是这种精确调节的基础遗传成分。先前的研究阐明了关键渗透调节基因（如Na⁺/K⁺-ATPase（NKA）、carbonic anhydrase（CA）和V-type H⁺-ATPase（VHA）的关键作用[5]。NKA通过建立电化学梯度来促进渗透调节[6]，CA有助于pH调节和全身酸碱平衡[7]，VHA通过将质子主动运输到外部环境来调节离子[8]。这些渗透调节基因可以独立或协同作用以实现必要的生理调整。

除了离子转运蛋白外，许多研究还强调了其他膜蛋白在增强盐度胁迫抵抗力中的重要作用。水通道蛋白（AQPs）是一类膜通道蛋白，能够促进水和甘油、尿素等小分子溶质的跨细胞膜运输[9]。它们属于主要的内在蛋白超家族，在所有生命领域中普遍存在[10]。至少有13种AQPs（AQP0–AQP12）在哺乳动物中被发现，并分为三类：经典水通道蛋白（如AQP4，主要选择性转运水）；水甘油通道蛋白（如AQP3，同时转运甘油和其他小中性溶质）；以及非经典水通道蛋白（如AQP11，定位于细胞内膜，其通透性特性不明确[10]、[11]、[12]。尽管哺乳动物的AQPs分类已经确立，但无脊椎动物的AQPs通常遵循不同的框架。值得注意的是，节肢动物的AQPs包括大脑（BIB）水通道蛋白，这种蛋白在Drosophila melanogaster中被功能鉴定为非选择性阳离子通道[13]、[14]。

在节肢动物中，甲壳类动物是少数研究过AQPs的群体之一。例如，在鲑鱼虱Lepeophtheirus salmonis中发现了7种AQPs，在藤壶Balanus improvisus中发现了8种[15]、[16]。此外，还使用in silico方法分析了端足类甲壳动物中AQPs的存在和多样性[17]。进一步的研究表明，当B. improvisus从海水环境转移到低盐度环境时，AQP1的表达显著下降，这表明其在渗透调节中起作用[15]。在十足类动物中，包括蟹Carcinus maenas和虾Fenneropenaeus chinensis及Macrobrachium australiense中，AQP基因的表达对盐度胁迫敏感，表明这些蛋白参与了渗透调节过程[18]、[19]、[20]。然而，在大多数研究中，AQPs在甲壳类动物中的功能作用仍属于推测。

在L. vannamei中，已鉴定出5种AQP基因：经典水通道蛋白LvAQP4、水甘油通道蛋白LvAQP3、非经典水通道蛋白LvAQP11、节肢动物特异性的LvBIB以及甲壳动物特异性的LvAQPL[21]。抑制LvAQP4会降低其他水通道蛋白和离子转运蛋白的表达，并在高盐度条件下显著增加虾的死亡率[3]。关于其他AQPs，LvAQP3主要在虾的肠道中表达[22]，肠道是维持水分和离子稳态的关键器官[23]、[24]。尽管肠道在渗透调节中起关键作用，并且确认LvAQP3存在于该组织中，但其具体生理功能仍不明确。阐明LvAQP3在肠道中的作用至关重要，因为肠道微生物群也对肠道屏障完整性、抵御病原体入侵以及整体肠道健康有重要影响，从而显著影响宿主的代谢、生长和免疫反应[25]。

本研究旨在阐明Lvannamei中LvAQP3的多方面作用，特别关注其在盐度适应、肠道稳态和抗病毒防御中的作用。通过RNA干扰（RNAi）技术抑制LvAQP3的表达，然后使用定量PCR（qPCR）评估虾对盐度胁迫的耐受性和离子转运蛋白的表达。通过组织学分析、16S rRNA测序和转录组测序，研究了LvAQP3敲低对肠道形态、微生物群多样性和组成以及全局基因表达谱的影响。此外，还测量了肠道中的死亡率和病毒拷贝数，以评估LvAQP3敲低对白斑综合征病毒（WSSV）感染的影响。

实验动物

实验动物

实验用的幼虾平均体重为3.6 ± 0.5克，平均长度为7.4 ± 0.4厘米，来自位于中国山东省潍坊市的BLUP Aquabreed有限公司的养殖中心。实验前，将这些虾在装有充氧自然海水的300升聚氯乙烯水箱中驯化一周，水温保持在28 ± 0.5°C，盐度为30，pH值为7.8。每天上午9点更换50%的水，同时保持溶解氧水平在6.0以上

LvAQP3敲低对虾在盐度胁迫下的存活影响

给予3 μg/g和5 μg/g体重的dsAQP3剂量后，LvAQP3的表达分别降低了44%和90%（图1A）。后续实验选择了5 μg/g的剂量。72小时后，LvAQP3的表达下降了53%，96小时后进一步降至37%（图1B），因此需要每72小时重新注射一次以维持沉默效果。此外，还评估了48小时后肠道中经典水通道蛋白LvAQP4和非经典水通道蛋白LvAQP11的表达情况

LvAQP3敲低对虾在盐度胁迫下的存活影响

本研究表明，dsAQP3组中血淋巴渗透压和离子浓度显著下降。此外，dsAQP3组在盐度胁迫下的渗透压和离子浓度变化比dsGFP组延迟。此外，LvAQP3敲低导致高盐度胁迫下的虾死亡率增加了36.7%。这些发现突显了水甘油通道蛋白（如LvAQP3）的关键作用

结论

我们的研究表明LvAQP3在调节L. vannamei的渗透调节和维持肠道稳态中起着关键作用。LvAQP3敲低导致血淋巴渗透压和离子浓度下降，干扰了离子转运蛋白的表达，并在高盐度条件下增加了死亡率。它还导致了肠道组织损伤和肠道微生物群的改变，减少了微生物多样性，为病原菌提供了有利的环境。

CRediT作者声明

概念构思：王中凯、王北北

数据整理：郝鹏远、张龙

形式分析：韩万宇、陈云星

资金获取：李玉泉、王中凯

调查：刘培良、刘文娟

方法学：宋轩、王中凯

项目管理：王中凯、李玉泉

资源：赵坤鹏、刁傲

软件：赵坤鹏

监督：李玉泉

验证：王北北

可视化：王北北

写作——初稿：王中凯、王北北

写作——审阅：

致谢

本研究得到了山东省重点研发计划（2024LZGC038）、国家重点研发计划（2022YFD2400203）以及山东省农业研究系统的虾蟹创新团队（SDAIT-15-011）的资助。