《Food Bioscience》：Combining toehold-mediated strand displacement reaction and CRISPR/Cas12a for ultrasensitive fluorescent aptasensing of aflatoxin B1
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黄曲霉毒素B1（AFB1）污染严重威胁食品安全，本研究通过集成等温DNA扩增与CRISPR/Cas12a系统构建了一种级联信号放大荧光传感平台，实现AFB1的痕量检测（检测限0.062 pg/mL），并展现出86.7%-103.9%的高回收率。该平台利用AFB1与aptamer结合后触发TSDR循环扩增，结合Cas12a的转录切割活性实现荧光信号放大，有效解决了复杂食品基质中的检测难题。
吴志辉|秦芳泽|马宇聪|严正宇|李向志|蒲洪斌|刘世刚
湖南省食品科学与生物技术重点实验室，湖南农业大学食品科学与技术学院，长沙410128，中国
摘要
黄曲霉毒素B1（AFB1）在农产品中的污染严重威胁食品安全。本文构建了一种级联信号放大的荧光适配体传感器，通过将等温DNA扩增与CRISPR/Cas12a系统结合，实现AFB1的超灵敏检测。具体而言，当AFB1与其适配体特异性结合时，适配体的互补DNA（cDNA）通过与可编程探针杂交，触发动态趾抓介导的链置换反应（TSDR）。TSDR策略成功实现了cDNA的循环利用并生成多个双链DNA（dsDNA）产物。随后，dsDNA激活Cas12a的切割活性，切割荧光标记的单链DNA报告分子，产生显著增强的荧光信号。因此，建立了一种AFB1检测的荧光开启方法。该适配体传感器能够准确定量检测AFB1，检测限为0.062 pg/mL，在AFB1添加的食品样本中显示出86.7%-103.9%的优良回收率。TSDR与CRISPR/Cas12a的创新结合，为复杂食品基质中的AFB1检测提供了一个低背景、高灵敏度和准确的传感平台。这项工作还为扩展CRISPR/Cas生物传感器在小分子检测中的应用提供了新的思路。
引言
黄曲霉毒素B1（AFB1）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的强致癌次级代谢物，广泛污染玉米和花生等农产品（Dong等人，2025年）。AFB1具有较高的热稳定性，长期摄入可能导致肝癌和免疫抑制等严重健康风险（Frangiamone等人，2024年；Lu等人，2025年）。因此，建立高效准确的AFB1检测方法对于确保食品安全具有重要意义。目前，尽管色谱法和免疫测定等传统技术非常可靠，但它们依赖于大型仪器和专业知识操作（Khayoon等人，2012年；Zhao等人，2024年），难以满足快速灵敏检测的需求。因此，开发具有高灵敏度、便捷性和可靠性的新AFB1检测策略非常重要。
近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）核酸酶系统已成为生物传感领域的强大工具（Lee等人，2024年；Xu等人，2025年）。CRISPR/Cas系统通过Cas核酸酶实现高效的RNA引导的核酸切割。特别是CRISPR/Cas12a系统通过CRISPR RNA（crRNA）与互补目标序列之间的碱基配对，能够通过单链DNA（ssDNA）的切割产生酶催化的信号放大。由于小分子缺乏天然的核酸靶标，通过适配体将其浓度信息转化为CRISPR可识别的核酸信号是一个可行的解决方案（Xiong等人，2020年）。例如，Ma等人开发了一种基于杂交链反应（HCR）和Cas12a切割活性的新型适配体传感策略，用于高灵敏度检测三磷酸腺苷（ATP）（Ma等人，2023年），该检测系统通过两阶段信号转换和放大机制实现了1.0 nmol/L的检测限（LOD），整个检测过程在100分钟内完成。Hu等人报道了一种基于空间阻断分裂CRISPR-Cas12a系统的新型检测平台，用于超灵敏检测谷胱甘肽，检测限为20 pmol/L（Hu等人，2025年）。这种策略结合了高灵敏度和低背景干扰的小分子检测新方法。因此，CRISPR/Cas12a系统在开发用于小分子检测的适配体方面具有巨大潜力（Sen等人，2024年；Zhang等人，2024年）。
近年来，研究人员探索了多种等温DNA扩增技术（Singh等人，2023年）。趾抓介导的链置换反应（TSDR）是一种无酶的等温扩增技术，具有高扩增效率和低背景信号等优点（Xu等人，2024年；Yu等人，2024年）。TSDR是一种DNA互补杂交过程，其中入侵的DNA链通过暴露的单链结构（称为趾抓）置换双链DNA（dsDNA）中的短链，生成新的dsDNA产物（Liu等人，2024年；Zhou等人，2021年）。与其他等温DNA扩增方法（如HCR（Zhu等人，2024年）或催化发夹组装（CHA）（Zeng等人，2022年）相比，TSDR通过精确设计的DNA序列实现目标的循环扩增，显著提高了信号放大效率，同时避免了复杂序列设计和过量DNA消耗的挑战（Song等人，2024年）。此外，通过调整短DNA链的长度和组成，可以精确调节TSDR的动力学特性，为构建高效可控的生物传感系统提供了新的可能性。
在本研究中，我们创新性地构建了一种基于TSDR和CRISPR/Cas12a系统组合的超灵敏AFB1适配体传感器，实现级联信号放大（图1）。该平台通过合理设计具有末端趾抓结构的A1/A2双链探针开发而成。在AFB1存在的情况下，AFB1与适配体结合，互补DNA（cDNA）触发高效的TSDR反应。随后引入燃料链（F）以实现cDNA的循环利用，最终生成大量含有原间隔序列（PAM）的A1/F dsDNA产物。这些产物有效激活Cas12a的切割活性，产生显著的荧光信号。因此，通过结合TSDR的高效循环扩增能力和CRISPR/Cas12a系统的催化放大优势，成功获得了超灵敏的AFB1传感平台。这项工作建立了一种新型传感方法，具有广泛的应用前景，可用于食品产品中微量小分子污染物的灵敏检测。
部分摘录
化学物质和材料
Lachnospiraceae菌株Cas12a（LbCas12a，cpf1）购自Tolo Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）。反应缓冲液A（40 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl，20 mmol/L MgCl2，pH 7.4）由北京Nobel Ryder Technology Co., Ltd.（中国北京）提供。所有核酸序列、DNA标记物（25-50 bp）、4S GelRed核酸染料和DEPC处理的无核酸酶水由Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）提供。天然聚丙烯酰胺凝胶（15%）用于电泳
检测原理
基于TSDR-CRISPR/Cas12a级联信号放大的荧光适配体传感器示意图如图1所示。提取后（图1A），AFB1优先特异性结合到适配体上，随后加入的cDNA与未结合的适配体互补配对（图1B）。剩余的cDNA与预先设计的A1/A2双链结构相互作用，通过趾抓1有效置换A2链，形成A1/cDNA双链结构。引入的燃料链F随后通过趾抓与A1链结合
结论
总之，成功开发了一种结合等温DNA扩增和CRISPR/Cas的荧光适配体传感器，实现了AFB1的低背景、高灵敏度和高特异性检测。该适配体的AFB1检测限为0.062 pg/mL。此外，在包括花生、玉米和杏仁在内的复杂基质中，使用该传感器检测AFB1时显示出86.7%-103.9%的优良回收率。此外，其检测结果与商业胶体金基方法高度一致
CRediT作者贡献声明
李向志：方法学、正式分析。严正宇：正式分析。马宇聪：资源、正式分析。秦芳泽：资源、正式分析。吴志辉：撰写——原始草稿、验证、方法学、资金获取、数据管理。刘世刚：撰写——审稿与编辑、监督、概念化。蒲洪斌：方法学、概念化利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢湖南省自然科学基金（2024JJ6237）、湖南省教育厅的科学研究基金（24B0202）以及国家自然科学基金（32102074）的财政支持。
