单一起始原料替代策略：基于非靶向代谢组学和气相色谱-质谱（GC–MS）的研究，揭示了Staphylococcus vitulinus蛋白酶在促进哈尔滨干香肠中蛋白质水解及风味提升中的作用

《Food Chemistry》：Single-starter replacement strategy: Insights from untargeted metabolomics and GC–MS into the role of Staphylococcus vitulinus protease in promoting protein hydrolysis and flavor enhancement in Harbin dry sausage

本研究以S. vitulinus蛋白酶为单一发酵起点，探究其对哈尔滨干香肠蛋白质降解及风味形成的影响。通过物理分析、GC-MS和代谢组学发现，该蛋白酶显著促进低分子量蛋白质积累及α-螺旋含量，增加肽类和游离氨基酸含量，并生成多种挥发性化合物如醛、酯、酮及酸，同时提升氨基酸代谢相关途径活性，最终有效改善产品风味与感官质量。

　　

范宇航|孙方达|陈倩|刘倩|张超|孔宝华

东北农业大学食品科学学院，中国黑龙江省哈尔滨市150030

摘要

本研究提出了一种替代策略，使用Staphylococcus vitulinus蛋白酶作为哈尔滨干香肠中唯一的发酵启动剂，并探讨了其作用机制。S. vitulinus蛋白酶促进了低分子量蛋白质（7–20 kDa）的积累，相应地增加了二级结构中α-螺旋和无规卷曲的含量。添加蛋白酶显著提高了肽和游离氨基酸（FAA）的含量（p < 0.05），增强了FAA的味觉活性值。代谢组学分析显示，味觉肽、氨基酸及其衍生物以及不饱和脂肪酸的水平升高。同时，包括醛、酯、酮和酸在内的挥发性化合物也有所增加。S. vitulinus蛋白酶的添加促进了蛋白质的消化和吸收、氨酰-tRNA的生物合成以及氨基酸的合成。分子对接分析表明，蛋白酶与肌球蛋白重链及磷酸化酶之间的主要相互作用是氢键。

引言

发酵肉制品具有独特的风味和口感，是高质量蛋白质、脂肪、维生素和矿物质的重要来源（Lv等人，2019年）。蛋白质，主要是肌原纤维蛋白（MP）（约占60.52%），不仅影响乳化性、持水能力和凝胶化等性能，还与脂肪和添加的糖一起，成为发酵肉制品中风味物质生成的主要前体（Chen等人，2024年；Wang等人，2022年）。这是因为在发酵过程中，蛋白质被内源性酶和微生物胞外酶降解为肽和游离氨基酸（FAA），这些物质随后参与挥发性化合物的形成（Fan, Badar等人，2025年）。这一过程被认为是发酵肉制品成熟度和品质发展的关键决定因素（Arslan等人，2024年）。然而，内源性酶（组织蛋白酶和类胰蛋白酶）的数量有限，且其活性在加工和后续成熟过程中会因pH值和水分含量等环境因素而逐渐下降，难以保证产品质量的稳定性（Arslan等人，2024年；Deng等人，2022年）。大量风味前体和风味化合物的产生依赖于细菌群落分泌的胞外蛋白酶，主要是乳酸菌和葡萄球菌（Wang等人，2025年）。先前的研究表明，微生物蛋白酶的活性随发酵时间的延长而增强，并与产品风味和质地的形成密切相关（Fan, Zhang, Liu, Liu等人，2025年）。Wang, Xu等人（2022a）观察到，接种S. carnosus可加速干香肠中的蛋白质水解，从而增加酯类挥发性化合物的含量。然而，关于其对其他风味化合物影响的全面研究仍然不足。

挥发性化合物通常通过光谱学、气相色谱-质谱（GC–MS）、气相色谱-离子迁移谱和气相色谱-嗅觉质谱进行分析。值得注意的是，GC–MS可以通过将挥发性化合物的碎片模式与已建立的质量谱数据库中的参考谱进行匹配来对其结构进行表征（Hu, Zhang等人，2022年）。Zhong等人（2021年）利用固相微萃取（SPME）结合GC–MS技术，在酸肉中鉴定出124种挥发性化合物，其中酯类、醇类和醛类是风味的主要贡献者。此外，组学方法在阐明风味形成机制方面显示出巨大潜力。近年来，代谢组学被广泛用于表征发酵过程中产生的小分子挥发性代谢物，包括寡肽、氨基酸及其衍生物（Wang等人，2022a）。Wang等人（2022a）采用非靶向代谢组学方法从腌肉的脂肪组分中鉴定出60种差异代谢物，包括甘油磷酸乙醇胺、甘油磷酸胆碱、二肽、脂肪酸和氨基酸。对挥发性和非挥发性代谢物的综合分析有助于全面理解发酵食品中的风味形成。

干发酵香肠是一种广泛消费的发酵肉制品，在西班牙和其他地区非常受欢迎（Ma等人，2023年）。其中，中国东北地区生产的哈尔滨干香肠是一种开放式发酵产品，传统上依赖自然发酵。这一过程有时会导致产品质量下降，表现为外观变化、保质期缩短以及潜在的健康风险增加（Wang, Wang, Pan等人，2021年）。因此，实际应用中采用了单一启动菌种来缩短加工时间，同时保证质量和风味的稳定性（Shao等人，2025年）。然而，这种方法在提高整体质量方面的效果有限，因为风味的提升仍然有限（Wang, Wang, Yang等人，2021年；Wu等人，2024年）。为了探索单一启动菌种策略的替代方案，使用多种启动菌种可以产生更优的风味和颜色特性（Li等人，2025年）。这与不同菌株的独特发酵特性有关，从而提供了更大的技术灵活性（Fan, Badar等人，2025年）。此外，还提出了使用外源酶来水解蛋白质作为微生物发酵的替代方法，但相关研究较少（Cruz-Casas等人，2021年）。蛋白酶在蛋白质水解方面具有显著优势，其特点是具有较高的肽键切割选择性以及可预测的肽产物特性（Arslan等人，2024年）。其中，来自发酵肉制品的葡萄球菌因其出色的酶产生能力而成为蛋白酶提取和应用的合适来源。图1描述了不同发酵条件的特点及涉及的基本途径。

在本研究中，选择了具有强蛋白水解活性的S. vitulinus；其蛋白酶已事先纯化并验证了其水解能力。研究了不同蛋白酶添加量对哈尔滨干香肠中蛋白质降解的影响。此外，还利用GC–MS和非靶向代谢组学方法探讨了挥发性化合物和非挥发性化合物之间的差异。本研究旨在深入理解蛋白酶如何影响发酵过程中的风味发展和品质特性。

部分摘录

启动菌种的制备

S. vitulinus从传统的哈尔滨干香肠中分离出来，并通过16S rDNA测序进行鉴定。将该菌株以1%（v/v）的浓度接种到MSA培养基中，在35°C下培养18小时，经过两代培养后收集细胞。收集细胞后，先在9000×g和4°C下离心去除可能影响香肠风味的杂质，然后重新悬浮在无菌水中并再次离心。通过计算相应的值来确定葡萄球菌的添加量

物理分析

图1(A)显示了不同发酵处理下干香肠的pH变化。随着发酵时间的延长，pH值从6.06（C0组）降至5.79（C组）（p < 0.05），这主要是由于发酵过程中微生物降解碳水化合物产生的有机酸所致（Hu, Wang等人，2022年）。添加S. vitulinus及其蛋白酶后，pH值也呈现类似的下降趋势。较低的pH值有利于改善

讨论

本实验引入了S. vitulinus及其不同水平的蛋白酶作为启动菌种，旨在确定能够替代单一启动菌种的最佳策略并阐明其作用机制。Staphylococcus通过碳水化合物和氨基酸的分解、酯的形成以及与脂肪酸的相互作用来提升香肠的感官品质（Jeong等人，2016年）。

结论

本研究开发了一种基于S. vitulinus蛋白酶的启动菌种，可作为传统单一启动菌种的替代方案，用于提升哈尔滨干香肠的风味和感官品质。我们重点研究了蛋白质水解的作用机制，包括降解模式、结构变化、挥发性和非挥发性化合物的谱型分析以及代谢途径分析。结果表明，添加S. vitulinus

CRediT作者贡献声明

范宇航：撰写初稿、数据可视化、数据管理。孙方达：数据管理、概念构思。陈倩：实验研究、数据分析。刘倩：软件操作、资源获取。张超：概念构思。孔宝华：撰写、审稿与编辑、方法指导、资金申请。

伦理声明

本研究中的感官评估遵循了《赫尔辛基宣言》的原则。作者确保在整个试验过程中保护参与者的权利和隐私。参与完全自愿，无任何强迫或健康风险。所有评估者均签署了同意书，数据仅在获得其知情同意后公开。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（32372373）的资助。