酶特异性结构修饰调控了大米蛋白水解物的界面性质和乳液稳定性

《Food Chemistry》：Enzyme-specific structural modifications regulate interfacial properties and emulsion stability of rice protein hydrolysates

本研究采用四种蛋白酶（Alcalase、Flavourzyme、Neutrase、Protamex）对大米蛋白进行水解，系统比较其结构和功能特性。结果表明Alcalase和Protamex生成的低分子量肽显著提升溶解度和界面张力降低能力，而Flavourzyme水解产物疏水性增强且溶解度受限。乳液稳定性分析显示酶类型和油比例（30–70%）均影响乳滴尺寸（343–517 nm）、分布及流变学特性，Flavourzyme和Neutrase处理的乳液形成单模态纳米乳液且ζ电位高度负值，而Alcalase和Protamex处理存在残留聚集体。

　　

Ju Yeon Ha|Mi-Jung Choi|Yeon-Ji Jo

韩国江陵-Wonju国立大学海洋生物食品科学系，江陵25457

摘要

在本研究中，使用四种蛋白酶（Alcalase、Flavourzyme、Neutrase和Protamex）制备了大米蛋白水解物（RPHs），并系统地比较了它们的结构和功能特性。Alcalase和Protamex产生了多种低分子量肽，这些肽提高了溶解度并降低了界面张力；而Flavourzyme主要释放了短肽和游离氨基酸，增加了疏水性但溶解度较低。乳液表征显示，滴径、分布和流变学性质受到酶类型和油含量（30–70%）的影响。在70%的油含量下，只有Flavourzyme和Protamex稳定的乳液可以被测量到，其中Flavourzyme表现出最高的粘度和屈服应力。高压均质化（HPH）进一步将滴径减小到343–517纳米，并提高了胶体稳定性。值得注意的是，Flavourzyme和Neutrase衍生的乳液形成了具有高度负ζ电位的单峰纳米乳液，而Alcalase和Protamex则形成了分布较宽的乳液。这些发现表明，蛋白酶的特异性和均质化条件协同作用，决定了肽的结构、界面行为和乳液的稳定性。

引言

近年来，对植物蛋白的需求增加，促进了各种乳化食品（如蛋黄酱、调味品、酱料、冰淇淋等）的发展（Pastrana-Pastrana, Rodríguez-Herrera, Solanilla-Duque, & Flores-Gallegos, 2025）。这一趋势受到食品安全、环境问题和动物福利等因素的推动，植物蛋白作为可持续食品成分的潜力受到了全球关注。然而，与动物蛋白相比，植物蛋白通常含有较高比例的β-折叠结构、较低的α-螺旋含量以及更多的纤维聚集物（Zhang et al., 2023），这些因素对其界面性质产生负面影响，导致乳液稳定性较低。

尽管存在这些限制，大米蛋白作为一种植物蛋白，仍是动物蛋白（如酪蛋白和乳清蛋白）的潜在替代品。大米蛋白具有平衡的必需氨基酸组成、低过敏性和优异的生物活性（包括抗氧化和抗高血压作用）（Wang, Li, Zhang, Yu, & Wang, 2025）。除了营养价值外，大米蛋白还适用于多种工业应用，包括制药、化妆品和饮料加工行业（Zheng, San, Xing, & Regenstein, 2024）。大米蛋白可用于各种食品中，如酱料、汤、肉制品和其他咸味配方。此外，由于其无麸质、非转基因和低过敏风险的特点，其作为替代性蛋白质成分的工业价值很高（Zhang et al., 2023; Amagliani, O'Regan, Kelly, & O'Mahony, 2017a）。

尽管有这些优点，但由于大米本身的蛋白质含量较低（7–9克/100克，而大豆平均超过40克/100克），以及消化率和溶解度较差，大米蛋白的工业生产仍受到限制。根据组成不同，大米蛋白可分为谷蛋白（碱/酸性，约80%）、白蛋白（水溶性，4–22%）、球蛋白（盐溶性，5–13%）和醇溶蛋白（1–5%）（Amagliani, O'Regan, Kelly, & O'Mahony, 2017b）。其中，作为大米主要成分的谷蛋白导致大米蛋白在水中的溶解度较低（Abdel-Aal, Youssef, Adel-Shehata, & El-Mahdy, 1986）；由于谷蛋白中含有大量的谷氨酰胺和天冬酰胺残基，其在中性pH条件下具有高度疏水性，从而影响了溶解度（Wang, Li, et al., 2025）。这是限制大米蛋白在食品工业中广泛应用的主要因素之一。

已经有许多关于使用各种植物蛋白（如绿豆（Son, Hong, & Jo, 2025）、豌豆（Yu, Feng, Long, Tao, & Zhang, 2025）、扁豆（Jo, Chu, & Chen, 2023）和红薯（Wang et al., 2025）分离物进行乳液形成和稳定的研究。大米蛋白也因其作为天然乳化剂和稳定剂的潜力而受到关注；然而，大多数大米蛋白表现出物理不稳定性，界面处的重排能力、疏水-亲水平衡和粒径分布等因素对乳液稳定性有负面影响。大米蛋白的沉淀现象表明其溶解度存在显著限制，而在其他植物蛋白来源中未见这种现象。这种低溶解度和有限的功能特性（如乳化、凝胶化等）是阻碍其作为食品成分应用的主要因素。因此，通过各种物理化学处理方法提高大米蛋白的水溶性和界面活性对于稳定和改善功能性乳化食品的质量至关重要。

有多种结构修饰技术可以改善大米蛋白的功能性并扩大其应用范围（Gao, Rao, & Chen, 2024）。酶促水解作为一种有效的技术受到了关注，它可以通过破坏蛋白质的二级结构并暴露大量极性基团来提高功能特性，如乳化性和发泡性（García Arteaga, Apéstegui Guardia, Muranyi, Eisner, & Schweiggert-Weisz, 2020）。水解产生的小分子多肽含有亲水区域，有助于与水分子相互作用，从而提高蛋白质的水溶性（Shahbal, Jing, Bhandari, Dayananda, & Prakash, 2023）。用于酶促水解的蛋白酶可从动物、植物和微生物来源获得，在安全性、经济性和特异性反应性方面具有优势。特别是，酶促水解能有效释放抗氧化肽，从而通过抑制脂质氧化来提高基于微粒的乳化食品的稳定性（Gomes & Kurozawa, 2023）。因此，酶促水解是一种可以同时实现蛋白质结构修饰和功能改进的方法。这被认为是提高植物蛋白，尤其是大米蛋白的水溶性和表面活性的一种有益方法。基于这一理解，本研究旨在通过使用商业蛋白酶（Alcalase、Flavourzyme、Neutrase和Protamex）进行酶促结构修饰，以克服大米蛋白的功能限制。

材料

大米蛋白（RP）分离物（蛋白质含量>70.9%）购自韩国仁川的One Day Nutrition公司。用于蛋白质水解的商业酶（包括Alcalase 2.4 L、Flavoenzyme、Nutrase和Protamex）购自丹麦的Novozymes公司。菜籽油购自韩国首尔的Sajo公司。所有水溶液均使用I型超纯水（New Pure Power II Scholar UV；Human Corporation，首尔，韩国）制备。所有试剂均为分析级。

使用商业酶制备的大米蛋白水解物的特性

图1A显示了经过不同酶处理后的大米蛋白（对照：RP上清液）和大米蛋白水解物（RPH）的外观。对照组和RPH-Au略微浑浊，而RPH-Al、RPH-Ne和RPH-Pr呈透明至淡黄色，表明由于低分子量肽的形成，溶解度提高且聚集减少，但潜在的副反应影响有限。

图1B展示了对照组、Au和酶处理后的SDS-PAGE图谱

结论

本研究表明，基于RP的乳液稳定性受到酶依赖性肽特性与界面吸附、滴液形成和流变行为的机制级联效应的调控。如图9所示，广谱内肽酶Alcalase和Protamex产生了多种肽，有效降低了界面张力并形成了具有小滴径的稳定乳液。然而，仍然存在残留的聚集物和多分散性。

作者贡献声明

Ju Yeon Ha：撰写——初稿、可视化、软件应用、方法设计、实验研究、数据分析。Mi-Jung Choi：资源获取、方法设计、实验研究、数据分析。Yeon-Ji Jo：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、验证、项目监督、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了韩国海洋科学技术院（KIMST）的支持，该机构由韩国海洋渔业部资助[RS-2024-00404779]。本研究还得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础研究计划的支持，该计划由韩国教育部资助[RS-2024-00412288]。