用于快速现场鉴定鲟鱼（Acipenser 和 Huso）的双重实时荧光与比色LAMP检测方法

《Food Chemistry》：Dual real-time fluorescent and colorimetric LAMP assay for rapid and on-site identification of sturgeon ( Acipenser and Huso)

本研究开发了一种双模式环介导等温扩增（LAMP）检测方法，结合实时荧光（SYTO-9）和闭管式颜色反应（氢氧化靛蓝），快速（10分钟）且高特异性（检测限0.1 pg DNA）鉴定鲟鱼源性成分，验证显示与测序结果一致，适用于市场监管和物种保护。

　　

赵佳|姚佳秀|卢玉晓|李向阳|刘森涛|马蒂·Z·华|亨利·K·罗蒂奇|拉拉·蒂纳奇|郑文杰|赵亮娟|卢晓楠

天津师范大学生命科学学院动物与植物抗性重点实验室，中国天津300387

摘要

用低价值的鱼子或非鲟鱼卵伪造鲟鱼鱼子酱的行为对消费者保护和鲟鱼资源保护构成威胁。本研究开发了一种双模式环介导等温扩增（LAMP）检测方法，用于快速、现场鉴定鱼子酱中的鲟鱼（Acipenseridae）成分。该方法将SYTO-9实时荧光技术和羟基萘酚蓝比色法集成在封闭试管系统中。针对鲟鱼（Acipenser）和虎鱼（Huso）细胞色素b基因的保守区域设计的引物可生成190 bp的扩增产物，在64°C下10分钟内检测到低至0.1 pg的鲟鱼基因组DNA，并伴随明显的天蓝色变化和荧光信号。该方法的分析特异性很高，14个非鲟鱼样本未发生扩增。使用17种商业鱼子酱产品的验证结果显示，其鉴定结果与基于测序的物种鉴定完全一致。该方法的简便性、快速性和封闭试管设计减少了设备需求和污染风险，适用于监管、商业和保护应用。

引言

鲟鱼是鲟科（Acipenseridae）中最古老的辐鳍鱼类之一。系统发育分析确定了四个属（Acipenser、Huso、Scaphirhynchus和Pseudoscaphirhynchus）中的23种现存物种（Hung, 2017）。作为适应欧亚和北美寒冷及温带水域的底栖-浮游鱼类，鲟鱼具有主要由软骨构成的内骨骼，生长缓慢且性成熟期晚（Birstein & DeSalle, 1998）。这些生活史特征，加上栖息地丧失、产卵地退化以及水环境污染，导致野生种群数量急剧下降（Haxton et al., 2024）。自1997年以来，所有鲟鱼物种均被列入《濒危物种国际贸易公约》附录以保护其免于灭绝（Pikitch et al., 2005）。为了满足全球需求同时减少对野生种群的压力，近年来鲟鱼养殖业得到了显著发展（Farag et al., 2021）。

除了生态和进化意义外，鲟鱼因其肉质和鱼子（鱼子酱）而具有很高的商业价值，鱼子酱历来被视为贵族和高级餐饮的奢侈品（Farag et al., 2021）。鲟鱼鱼子酱的制作过程包括将成熟的鱼子轻轻盐腌后进行低温处理，以获得其特有的质地、硬度和细腻的风味。从营养角度来看，鱼子酱约含50%的水分，富含二十碳五烯酸（EPA；C20:5n-3）和二十二碳六烯酸（DHA；C22:6n-3）等高质量蛋白质，以及所有必需氨基酸（Mol & Turan, 2008）。其中的高水平长链多不饱和欧米伽-3脂肪酸有助于心血管健康，可能有助于预防心脏病（Mol & Turan, 2008）。

全球对鲟鱼鱼子酱等高端海产品的需求持续增长。然而，包括仿制鱼子酱、错误标注以及用其他鱼类鱼子替代在内的欺诈行为仍然普遍存在（Dudu et al., 2022）。这些掺假行为误导了消费者，破坏了对受威胁鲟鱼物种的保护工作。一项针对美国市场的调查显示，高达23%的鱼子酱样本的标注与实际鲟鱼种类不符（Farag et al., 2021）。为了打击此类欺诈行为并支持监管执法和保护工作，迫切需要快速可靠的现场鉴定工具。

已经开发了几种用于鱼子酱鉴定的分析方法。传统的感官评估可以评估新鲜度和质量，但严重依赖训练有素的人员和主观判断（Rodrigues et al., 2024）。基于蛋白质的检测方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和色谱法，可以提供客观分析，但通常仅适用于新鲜或轻度加工的样本，在复杂或高度加工的样本中准确性较低（Cermakova et al., 2023）。因此，强大、快速且普遍适用的分子鉴定工具对于确保标签真实性和合规性至关重要。基于DNA的方法已成为物种鉴定的基石。聚合酶链反应（PCR）检测方法，包括实时和多重扩增格式，由于其高特异性和灵敏度而成为金标准。然而，PCR需要复杂的加热装置和熟练的操作人员，不太适合快速或现场检测（Silva & Hellberg, 2021）。因此，越来越需要更简单、更快捷且无需仪器的分子方法，以便在现场使用。

环介导等温扩增（LAMP）作为一种强大的替代技术应运而生。该技术使用链置换DNA聚合酶和四到六个引物，能够在一个恒定温度（60–65°C）下30–60分钟内实现高达10^9倍的DNA扩增（Notomi et al., 2000）。LAMP的等温特性消除了对热循环的需求，仅需简单设备如水浴。其稳健性和快速性使其非常适合现场分子检测，特别是加工食品的鉴定。扩增过程中产生的焦磷酸镁副产物可通过浊度或比色指标进行视觉检测（Wong et al., 2018）。在比色LAMP检测中，pH敏感染料（如酚红）对质子释放作出反应，而金属离子指示剂（如羟基萘酚蓝（HNB）在Mg^2+耗尽时产生从紫色到蓝色的颜色变化（Selva Sharma & Lee, 2024），从而在20–30分钟内无需特殊仪器即可实现视觉检测。然而，终点视觉LAMP检测可能因非特异性扩增或引物二聚体形成而出现假阳性，导致结果解释复杂化。荧光LAMP检测通过加入插入染料（如SYBR Green I、EvaGreen或SYTO系列）克服了这一限制，这些染料的荧光强度与双链DNA产物的积累成正比，从而实现实时动态监测，生成特征性的S形扩增曲线，区分真实阳性和背景噪声，并能在复杂样本中检测到微量目标拷贝（Fischbach et al., 2015）。

在本研究中，我们开发了一种双模式LAMP检测方法，将HNB和SYTO-9染料直接集成到封闭试管反应系统中，以提高现场检测的简便性和可靠性。HNB作为金属离子指示剂，在DNA合成过程中Mg^2+被消耗时产生从紫色到天蓝色的颜色变化，而SYTO-9则插入双链DNA并产生实时荧光，同时不抑制聚合酶活性。在扩增前加入这两种染料可实现密封试管操作，最小化气溶胶污染和假阳性。Acipenser baerii被选为优化检测的代表性物种，该方法使用Acipenser和Huso属的样本进行了验证。这种双模式系统在10分钟内提供交叉验证的比色和荧光读数，能够快速可靠地鉴定鱼子酱中的鲟鱼（Acipenseridae）成分。

样本采集

从当地市场获取了14种鱼类样本，包括Siganus canaliculatus、Acanthopagrus schlegelii、Larimichthys crocea、Mugil cephalus、Katsuwonus pelamis、Sphyraena属物种、Trachurus japonicus、Lateolabrax japonicus、Epinephelus属物种、Trachinotus ovatus、Scomberomorus niphonius、Salmo salar、Oncorhynchus mykiss和Gadus chalcogrammus，这些样本为新鲜或冷冻状态，用作评估该方法分析特异性的非目标参考材料。

实时荧光LAMP的优化

LAMP扩增的效率受目标DNA片段大小的影响较大，因为链置换合成是反应中的限速步骤（Notomi et al., 2000）。先前的研究表明，当目标长度低于300 bp时可实现最佳扩增效果（Notomi et al., 2000）。因此，我们设计了生成190 bp扩增产物的引物组合，提高了链置换效率和整体扩增性能（表1）。

结论

我们开发了一种快速的双模式LAMP检测方法，结合了实时SYTO-9荧光和封闭试管中的HNB比色技术，用于现场鉴定鲟鱼物种。该方法可可靠地检测低至0.1 pg的基因组DNA，在10分钟内产生明显的颜色变化。使用商业鱼子酱样本的验证显示，检测结果与基于测序的鉴定结果完全一致，证实了其在市场监督和质量控制中的潜力。

CRediT作者贡献声明

赵佳：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，方法学，研究。姚佳秀：撰写 – 原稿，验证，方法学，正式分析，数据管理。卢玉晓：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，研究，正式分析。李向阳：验证，方法学，数据管理。刘森涛：验证，方法学，数据管理。马蒂·Z·华：撰写 – 审稿与编辑，方法学，

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了天津市科技项目（23YFZCSN00260和25YFGKHZ00030）、肯尼亚标准局科技项目（2025KEBS/R&D/1/1）以及加拿大研究主席计划（资助编号CRC-2024-00011）的支持。