通过简化的亲和识别策略，利用人工抗体-抗原介导的脂肪酶固定化技术实现生物催化风味酯的合成（该过程通过酯交换反应完成）

《Food Chemistry》：Artificial antibody-antigen-mediated lipase immobilization via a simplified affinity recognition strategy for biocatalytic flavor ester synthesis through transesterification

人工抗体-抗原定向固定化技术构建脂酶生物反应器，实现酯化反应生产肉桂醇酯等风味酯，效率达97.18%，验证分子模拟与DFT计算指导的固定化方法兼具高活性和稳定性。

　　

赵红丽|王静|王毅|田静|杨毅

大连理工大学轻工与化学工程学院，中国大连116034

摘要

风味酯在食品和化妆品行业中被广泛使用，但其可持续生产仍然具有挑战性。本研究通过人工抗体-抗原导向的固定化方法开发了一种脂肪酶生物反应器，用于通过酯交换反应生物催化合成风味酯。人工抗原是通过用对硝基苯甲醛修饰脂肪酶制备的，而人工抗体则是使用2-(4-硝基苯基)-1,3-二氧杂环烷（对硝基苯甲醛的缩醛保护类似物）作为模板分子合成的。这些组分自组装成固定化的脂肪酶，固定化效率为82.24±0.13%，容量为17.59±0.12 mg/g，比活性为8.81±0.27 U/mg。结合分子模拟和酰基供体筛选，该生物反应器从肉桂醇和醋酸乙烯合成肉桂醋酸的产率为97.18±0.93%。该系统展示了出色的连续催化能力和可扩展性，证实了其工业化应用的潜力。成功合成了肉桂丁酸（86.25±3.34%）和苯乙酸（90.68±2.25%），进一步证明了其作为多种风味酯生产平台的多样性。

引言

风味酯是通过嗅觉或味觉可以感知的化合物（Luo等人，2019年）。作为重要的风味和香气成分，随着生活水平的提高，对它们的需求也在增加。这些酯在食品、饮料、化妆品、制药、化工和个人护理行业中起着关键的作用（Sá等人，2017年）。经典的芳香酯——包括肉桂醋酸、肉桂丁酸和苯乙酸——具有双重工业价值：既能够应用于广泛的食品领域，又能在奢侈品中提供竞争优势。肉桂醋酸赋予食品甜花香果味，并作为食用香料、香水和高档香水的关键成分（Tomke & Rathod，2015年）。其独特的肉桂酸结构赋予了抗氧化生物活性（Nenadis等人，2004年）。肉桂丁酸具有温暖甜美的果香辛辣特性，作为基础调配剂，其功能与肉桂醋酸相似（Belsito等人，2007年）。苯乙酸天然存在于丁香和洋甘菊中，具有茉莉-梨的融合香气（Balaei, Pouraghajan等人，2025年）。由于其独特的嗅觉特征和稳定性，它在香水制造和高端食品调味中不可或缺，是合成香料中用量最大的成分之一（McGinty等人，2012年）。

传统的肉桂酯生产依赖于植物提取——这种方法受季节性气候影响、产量不高且纯化成本高，限制了其商业可行性（Gumel & Annuar，2016年）。酸催化的醇-酸缩合具有经济优势，但存在环境不兼容性、产生有毒副产物以及反应条件苛刻的问题。这类反应的工业可行底物通常是C3–C8脂肪醇或糖醇，然而由于竞争性的聚合反应，烯丙醇的酸催化酯化研究较少（Kovalenko等人，2021年）。因此，肉桂酯主要通过肉桂醇和乙烯酯之间的酯交换反应，使用化学或酶催化剂合成（Waghmare等人，2017年）。随着食品和化妆品行业对可持续工艺的重视，酶催化的酯交换反应正成为首选的合成路线（Wang等人，2015年）。

脂肪酶因其对酯键的特异性而在酯合成催化中得到广泛应用（Balaei等人，2025年；Yu等人，2025年）。然而，游离酶的固有不稳定性和有限的重复使用性显著增加了工业生物催化的成本（Guo等人，2023年）。为了解决这些问题，已经开发了多种酶固定化策略——包括吸附、包封和交联——以提高功能稳定性，同时保持催化效率、特异性和选择性（Wang等人，2022年）。此外，来自黑曲霉（Aspergillus niger）的脂肪酶具有优异的稳定性和广泛的应用性，因此成为本文的研究模型（Thangaraj & Solomon，2019年；Xia等人，2017年）。

在固定化方法中，人工抗体-抗原导向的固定化（3ADI）模仿了天然抗体-抗原识别机制，实现了更好的酶稳定性（Guo, Guo等人，2024年）。该方法使用一对相差一个醛基的导航分子（例如，儿茶酚和3,4-二羟基苯甲醛）。不含醛基的分子通过聚合反应合成人工抗体，而含醛基的分子通过席夫碱形成修饰酶，生成人工抗原。抗体-抗原的组装是通过抗原中的特定结构基序（儿茶酚）实现的（Guo, Liu等人，2024年）。扩展到多酶系统时，3ADI仍然使用配对的导航分子，但分别用含醛基的化合物修饰不同的酶（Liu, Chao, Guo等人，2025年）。这种方法产生的酶比例随机，影响了级联反应的精确度并限制了产量（Liu, Chao, He等人，2025年）。因此，发展出了多模板3ADI，利用多对导航分子。通过调节模板分子的比例，该方法可以控制酶的化学计量比，从而优化级联产率（Guo等人，2026年）。尽管已经确定了四种适合3ADI的导航分子对，即儿茶酚/3,4-二甲基苯甲醛、间苯二酚/2,4-二甲基苯甲醛、氢醌/2,5-二甲基苯甲醛和4-氨基嘧啶/4-氨基-5-醛嘧啶，但找到具有商业可行性的替代方案仍然具有挑战性。多模板3ADI系统需要额外的导航分子对来增强应用灵活性，这进一步加剧了这一限制。

用醇保护醛基形成缩醛是一种基本的有机转化。由于缩醛中的醚键具有化学稳定性，它们与人工抗体活性位点的相互作用较弱，因此对分子亲和力识别影响不大。因此，任何含有非醛基H键供体/受体的醛都可以替代3ADI系统中的传统导航分子对。被保护的醛（缩醛）作为合成人工抗体的模板，随后脱保护后重新生成原始醛，进而修饰酶形成人工抗原，从而实现固定化酶的组装。然而，这种方法存在显著的立体阻碍：较大的缩醛基团可能会扭曲人工抗体上的表面印迹空腔，影响识别能力，导致固定失败。如果这一策略得到验证，将消除3ADI构建中对配对导航分子的需求，只需要鉴定单个醛基。

本研究验证了上述假设，构建了一个用于通过酯交换反应生物催化合成风味酯的固定化脂肪酶系统。对硝基苯甲醛（p-NBA）作为抗体-抗原识别的分子桥梁。具体来说，其乙二醇保护的缩醛衍生物用作合成人工抗体的模板分子，而未保护的醛用于修饰脂肪酶，形成人工抗原。随后，这些组分之间的亲和力识别使得固定化脂肪酶系统的组装成为可能。分子模拟通过计算保护/未保护醛基与功能单体之间的相互作用增强了信心。结果证实了缩醛结构保持了分子识别的准确性。通过一个脂肪酶系统合成肉桂醋酸、肉桂丁酸和苯乙酸的实验验证了这一假设。密度泛函理论（DFT）计算进一步阐明了肉桂醋酸合成的动力学过程和机制。

材料

来自黑曲霉（Aspergillus niger）的脂肪酶（固体粉末形式）从中国北京的Solarbio购买。Coomassie brilliant blue G-250、顺式-顺式-μ-康酸（MA）、异康酸、烯丙基马来酸、乙烯基三甲硅烷（VTTS）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、2,2-偶氮异丁腈（AIBN）、4-硝基苯基棕榈酸（p-NPP）和对硝基苯甲醛（p-NBA）从中国上海的Aladdin Biotechnology Co., Ltd.购买。四乙基正硅酸盐（TEOS）来自天津Komeo Chemical Reagent Co., Ltd.

功能单体的选择

通过分子印迹制备人工抗体需要仔细选择能够准确结合目标分子的功能单体。通过分子模拟评估了模板分子与三种候选功能单体（MA、异康酸和烯丙基马来酸）之间的结合亲和力。理论计算显示，p-NPD与MA之间的相互作用具有最强的结合能（-9.27 kcal/mol）。

结论

本研究开发了一种简化的3ADI方法，用于通过酯交换反应构建脂肪酶反应器，以生物催化合成风味酯。该方法使用p-NPD（醛保护的模板）合成人工抗体，而p-NBA修饰的脂肪酶作为人工抗原。硝基苯结构的亲和力识别使得通过抗原-抗体组装实现酶的固定化。重要的是，这种方法消除了传统3ADI对配对锚定分子的要求。

CRediT作者贡献声明

赵红丽：撰写——原始草稿，研究，数据管理。王静：正式分析，数据管理。王毅：软件，方法学。田静：项目管理，资金获取。杨毅：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了辽宁省高校基本研究项目（编号：LJ212510152014）和中国国家自然科学基金（编号：22278045）的资助。