《Food Control》：Sunflower pollen microgel-reinforced Ca-alginate hydrogel beads for protein glutaminase immobilization: Gelation and colloidal behavior and insights into flaxseed protein deamidation modification
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本研究开发了一种基于向日葵花粉微凝胶（SPMG）与Ca-alginate水凝胶的复合凝胶载体，用于固定化蛋白酶PG。优化SPMG与Alg体积比为2:1时，固定化PG的活性显著提升，并表现出优异的pH、温度稳定性和长期储存性能。该复合载体通过氢键及Ca2?协同作用调控微结构与水分分布，有效缓解传质阻力。利用固定化PG对亚麻籽蛋白 isolate（FPI）进行脱酰胺改性，显著提高其溶解性（近100%）、发泡性（50%）和乳化性（70%），同时降低苦味。通过SDS-PAGE、粒径分析、zeta电位及光谱表征，揭示了蛋白质分子结构变化与界面流变学关联。本研究为酶固定化技术及蛋白质功能改性提供了新思路。
陈尚文|唐晓倩|黄亚文|赵泽|苗松|彭登峰|陈亚舒|周斌|邓千春|邓子瑜
中国农业科学院油料作物研究所油料加工重点实验室，中国湖北省武汉市，430062
摘要
蛋白酶固定化过程中常常面临活性损失和质量传递阻力等问题。本研究开发了一种基于向日葵花粉微凝胶（SPMG）和海藻酸钙水凝胶珠的新型复合凝胶载体，用于固定谷氨酰胺酶（PG）。添加SPMG显著提高了固定在复合凝胶载体上的PG的活性，最佳SPMG与海藻酸（Alg）的体积比为2:1。与游离PG相比，固定化的PG在pH值和温度耐受性方面表现出显著改善，并且储存稳定性也有所提高。这些效果可能是由于SPMG通过与Alg的氢键相互作用改变了载体的微观结构和水分布，以及它们与Ca2+的相互作用，从而调节了固定化PG的性能。随后，将载体固定的PG用于亚麻籽蛋白分离物（FPI）的脱酰胺改性，以增强其功能特性和风味。在适当的脱酰胺水平下，固定化的PG使FPI的溶解度提高了近100%，起泡性提高了50%，乳化性提高了70%，同时显著降低了其苦味。进一步通过SDS-PAGE、粒径、Zeta电位、微观结构和光谱特性分析来表征改性FPI的分子结构变化，并结合界面流变学分析了其背后的机制。本研究阐明了SPMG掺入对凝胶载体性能的影响，这可能有助于调节固定化PG的性能，并为酶固定化提供了新的视角。
引言
植物蛋白由于其较大的市场份额和生产过程中的低碳排放而受到越来越多的关注（Sá等人，2020；Tan等人，2023）。然而，植物蛋白富含谷氨酰胺基团，这些基团之间的氢键交联容易导致蛋白质聚集和沉淀（Zenker等人，2020），从而降低蛋白质的溶解度，不利地影响其他功能特性（如起泡性、乳化性和凝胶化能力），并阻碍其在食品工业中的应用（Hu等人，2022；Karabulut等人，2024）。脱酰胺改性是指将蛋白质中的酰胺键转化为羧基，这可以增加分子间的排斥力，减弱氢键相互作用，并展开蛋白质构象，从而提高其溶解度（T.-H. Li等人，2024）。物理和化学方法进行蛋白质脱酰胺存在随机性和安全性低等缺点，而酶法脱酰胺则具有安全性和高效性的优势（X. Liu等人，2022；Zhou等人，2018）。谷氨酰胺酶（PG）因其仅催化蛋白质侧链上的谷氨酰胺残基而不引起蛋白质水解而受到广泛关注（X. Liu等人，2022）。研究表明，当使用PG处理小麦面筋蛋白时，其功能特性的改善并不一定与脱酰胺程度的增加呈正相关（Ma等人，2023）。因此，控制脱酰胺过程对于精确调节蛋白质功能特性至关重要，而稳定的PG活性是实现这一目标的前提。游离PG容易聚集并发生自脱酰胺，导致活性和稳定性下降（Wijerathne等人，2024）。此外，游离PG难以从反应系统中分离出来（Liu等人，2023）。这些限制大大限制了其在食品工业中的应用。酶固定化有望提高PG的稳定性和利用率，从而实现其可控的脱酰胺。然而，当前的固定化技术面临在过程中保持酶活性的挑战，因为固定化载体的组成和结构直接影响固定化酶的性能（Aziz等人，2022；Wliz?o等人，2020；Zhong等人，2024）。特别是对于固定的蛋白酶，蛋白酶分子及其底物都是大分子。结构变化（Feng等人，2017）、空间位阻效应（Bilal等人，2024；Siar等人，2024）和扩散限制效应（Bahamondes & Illanes，2018）都可能导致固定化蛋白酶的活性损失。因此，在蛋白酶固定化技术中维持甚至提高蛋白酶活性至关重要（Matveeva & Bronstein，2021）。
类似于制皂过程，向日葵花粉微凝胶（SPMG）是通过简单的工程策略形成的，使向日葵花粉颗粒膨胀并连接在一起，同时保持其结构完整性，最终形成微凝胶（Fan等人，2020；Zhou等人，2024）。SPMG具有坚硬的外壁和柔软的内壁，外壁由孢粉素组成，具有优异的生物相容性和机械性能，内壁则包含纤维素、半纤维素和果胶（Deng等人，2021；Deng等人，2020；Fan等人，2020；Zhou等人，2024）。SPMG具有丰富的纳米孔和微孔，增加了比表面积，形成了天然的多级孔结构（Fan等人，2020；Zhou等人，2024）。SPMG含有丰富的官能团，如羧基、羟基和酚基，易于改性（Fan等人，2020；Zhou等人，2024）。此外，SPMG安全、环保且可生物降解，符合食品工业的应用要求（Urcan等人，2024；Zhou等人，2024），因此作为一种新型酶固定化载体具有潜力。我们之前的研究也表明，SPMG可以提高PG的活性和稳定性（Chen等人，2025）。然而，其凝胶强度较低，导致重复使用性较差。海藻酸钙凝胶因其优异的分离性能而常用于构建酶固定化载体（Deng等人，2019）。然而，海藻酸钙的孔结构较密集，对固定化酶的质量传递存在显著阻力。扩散限制会阻碍底物蛋白质进入孔内以及产物分子的排出，从而不利地影响固定化酶的酶学性能（Z. Zhang等人，2023）。将SPMG与海藻酸（Alg）结合可以使用于制备新型复合凝胶。一方面，SPMG和Alg都含有大量官能团，有利于蛋白酶分子的轻松改性并促进其高效固定；另一方面，SPMG可为复合凝胶赋予独特的多级孔结构，而海藻酸钙则使其具有较高的凝胶强度（Fan等人，2020）。这种方法避免了由于载体孔径过小导致的高质量传递阻力以及由于孔径过大导致的酶脱落和泄漏问题，这对于提高固定化蛋白酶的活性和稳定性至关重要（Y. Li等人，2024；Z. Zhang等人，2023）。亚麻籽蛋白分离物（FPI）是一种特殊的油料蛋白，具有平衡的氨基酸组成和强大的功能活性（Sharma & Saini，2022；Z. Wang等人，2025）；但由于其含有丰富的谷氨酰胺残基，其功能特性并不理想。适度的、可控的脱酰胺改性可以改善FPI的功能特性，从而扩大其应用范围。
在本研究中，为了解决传统固定化技术中酶不稳定性和显著的质量传递阻力问题（Wu等人，2025），我们结合了SPMG和海藻酸钙凝胶来构建一种新型复合凝胶作为PG的固定化载体，通过控制复合凝胶载体的性能来调节固定化PG的性能（Chen等人，2025），从而提高PG的稳定性并扩展其在食品工业中的应用范围。首先，我们优化了SPMG的加载量和固定化方法，测试了固定化PG的酶学性能，并比较了SPMG改性前后载体的形态、结构、水分分布和光谱特性，以阐明不同固定化效果的原因。最后，为了测试复合凝胶载体固定化PG在增强蛋白质性能方面的应用潜力，我们将复合凝胶载体固定的PG应用于亚麻籽蛋白分离物（FPI）的脱酰胺改性，并从功能特性、感官特性、微观结构、光谱特征和界面特性的角度阐明了脱酰胺程度对蛋白质性能和结构的影响。总体而言，本研究可能为食品工业中的酶固定化提供一种新的载体。
材料
向日葵花粉由Belle Bee Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）提供。PG购自Amano Enzyme Preparation Co., Ltd.（日本）。亚麻籽来自Liupan Zhenfang Ecological Agricultural Technology Co., Ltd.（中国宁夏）。谷氨酰-甘氨酸（Cbz-Gln-Gly）购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。β-巯基乙醇和8-氨基萘-1-磺酸购自美国Sigma-Aldrich公司。BCA蛋白
用于固定PG的复合凝胶微球的制备和性质
图1a展示了Alg-CaCl2凝胶珠和SPMG-Alg-CaCl2复合凝胶珠的制备过程以及PG的固定化过程。首先，SPMG均匀分布在由Alg和Ca2+形成的“蛋壳”网络结构中，分子之间可能发生多种相互作用（如氢键和静电相互作用），共同构成了一个特殊的网络结构，为载体提供了更多的反应位点（如羧基）。然后，
结论
总之，本研究将SPMG与海藻酸钙结合，制备了一种新型复合凝胶载体，用于固定PG，然后利用固定化的PG对FPI进行改性。SPMG与Alg之间的氢键相互作用以及它们与Ca2+的相互作用协同改变了载体的微观结构和物理化学微环境。当SPMG与Alg的体积比为2:1时，实现了PG的最佳固定效果。
CRediT作者贡献声明
彭登峰：可视化、验证、研究、数据管理。苗松：可视化、验证、研究、数据管理。赵泽：撰写——审稿与编辑、可视化、数据管理。黄亚文：撰写——审稿与编辑、可视化、数据管理。邓子瑜：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。邓千春：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。周斌：可视化、验证、研究、数据管理。
未引用参考文献
Li等人，2018；Li等人，2024；Li等人，2018；Liu等人，2022；Wang等人，2023；Wang等人，2025；Wang等人，2021；Zhang等人，2023；Zhang等人，2023。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（批准号：32302149）、国家重点研发计划（2024YFD1600105）、中国农业科学院中央公益科学机构基础研究基金（编号：1610172023005）、武汉-曙光项目的知识创新计划（中国农业科学院油料作物研究所，项目编号：2023020201020397）以及中国农业研究专项资金的财政支持。
