《Food Research International》：Integrated enzymatic–yeast biostrategy to obtain reduced-alcohol wine
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葡萄过熟导致葡萄酒酸度降低、酒精度升高的问题，通过固定化葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶（GOX-CAT）胶囊预处理葡萄汁，降解17.3%葡萄糖，并利用耐热性弱的裂殖酵母Sp3发酵，进一步降解残留葡萄糖酸，实现酒精度降低1.0-1.3%vol且pH稳定在3.5以下，形成创新性应对全球变暖的复合工艺。
大卫·德尔-博斯克（David Del-Bosque）| 约瑟菲娜·维拉-克雷斯波（Josefina Vila-Crespo）| 维奥莱塔·鲁伊佩雷斯（Violeta Ruipérez）| 恩卡纳西奥娜·费尔南德斯-费尔南德斯（Encarnación Fernández-Fernández）| 何塞·曼努埃尔·罗德里格斯-诺加莱斯（José Manuel Rodríguez-Nogales）
食品技术领域，瓦拉多利德大学农业工程高等技术学院，西班牙帕伦西亚34004
摘要
由于全球变暖，葡萄过度成熟会导致葡萄酒成分失衡，表现为酒精含量升高、酸度降低以及感官特性改变。使用固定在硅钙藻酸盐水凝胶胶囊中的葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶系统对葡萄汁进行预发酵处理后，48小时内可降解葡萄汁中高达17.3%的葡萄糖，从而生产出酒精浓度降低1.0–1.3%（体积百分比）的葡萄酒。葡萄糖氧化产生的大部分葡萄糖酸被保留在胶囊中，这有助于减缓pH值的下降，避免葡萄汁过度酸化。剩余的葡萄糖酸在发酵过程中通过选定的Schizosaccharomyces pombe (S. pombe)酵母菌株被进一步降解。无论是使用胶囊中的酶系统还是单独或与Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)联合接种S. pombe，都能获得成分均衡的葡萄酒。这种结合预发酵和发酵过程的方法是一种创新且有前景的策略，目前尚未被广泛研究，可用于应对全球变暖导致的温度升高带来的不利影响。
引言
全球变暖导致的温度加速且持续上升会显著影响葡萄的化学成分（Van Leeuwen等人，2024年；Venios、Korkas、Nisiotou和Banilas，2020年）。某些葡萄品种，如Verdejo，由于特定的农业气候条件和生理特性（如：(i) 中短生长周期（比其他白葡萄品种更早成熟），(ii) 高光合作用效率（能快速积累糖分），(iii) 厚度较薄的果皮和多汁的果肉（在极端高温下容易脱水并导致酸度下降），以及 (iv) 对温度敏感的芳香物质（其芳香化合物在温暖夜晚会分解）（Azuara、González、Mangas和Martín，2023年；Ramos和Yuste，2023年），对温度变化尤为敏感。
在全球变暖的背景下，随着温度升高和昼夜温差减小，葡萄中的酚类和芳香物质的成熟速度将慢于糖分的成熟速度。果实着色期的提前以及葡萄快速的技术性成熟会导致两个关键问题：葡萄中可发酵糖分浓度升高和酸度下降，进而使pH值上升（Droulia和Charalampopoulos，2022年；González-Barreiro、Rial-Otero、Cancho-Grande和Simal-Gándara，2015年）。因此，所得葡萄汁可能会在酿酒过程中出现物理化学和微生物方面的变化，导致各种问题，以及葡萄酒感官上的不平衡和/或缺陷。可发酵糖分含量的增加可能导致葡萄酒的酒精浓度升高1.0–1.5%（体积百分比），从而影响其品质和风味（Godden、Wilkes和Johnson，2015年；Jord?o、Vilela和Cosme，2015年）。酸度下降和pH值超过3.5会导致葡萄酒失去新鲜感和芳香特性，使其更容易发生氧化和微生物污染（Botezatu、Elizondo、Bajec和Miller，2021年；Mangas、González、Martín和Rodríguez-Nogales，2023年；Soler、Del Fresno、Ba?uelos、Morata和Loira，2025年）。
为了解决这一问题，我们的研究团队正在探索一种创新的预发酵策略，即使用固定在硅钙藻酸盐水凝胶胶囊中的葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶（GOX-CAT）系统来降低葡萄汁中的葡萄糖含量，从而抑制葡萄过度成熟（Del-Bosque、Vila-Crespo、Ruipérez、Fernández-Fernández和Rodríguez-Nogales，2023a；Del-Bosque、Vila-Crespo、Ruipérez、Fernández-Fernández和Rodríguez-Nogales，2023b），同时将葡萄汁的高pH值（3.8）降至适宜酿酒的范围（< 3.5）。
GOX是一种黄素蛋白，可催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢（H?O?），从而减少葡萄汁中这种可被酵母发酵的糖分含量。生成的H?O?会与氧气竞争性地抑制GOX的活性（Majumdar、Khan和Bandyopadhyaya，2016年）。过高的H?O?浓度还可能抑制后续的发酵过程（R?cker、Schmitt、Pasch、Ebert和Grossmann，2016年）。因此，将过氧化氢酶（CAT）加入水凝胶胶囊中，使其将H?O?分解为水和氧气。正如Del-Bosque等人（2023a）所描述的，GOX-CAT酶系统的固定是通过将其包裹在硅钙藻酸盐多孔水凝胶中实现的，这种胶囊呈球形，能最大化与葡萄汁的接触面积。实验结果表明，在pH值3.20–3.60和低温（10–15°C）条件下，固定化的GOX酶的活性高于游离酶。随后，Del-Bosque等人（2023b）证实了该固定化酶系统在Verdejo葡萄汁中的处理效果，可使潜在酒精浓度降低高达2.0%（体积百分比）。
本研究旨在探索将发酵策略作为酶预发酵策略的补充。为此，我们选用了特定的S. pombe菌株，以减少葡萄汁中残留的葡萄糖酸浓度，并通过这种酵母独特的代谢途径提升最终葡萄酒的品质。S. pombe能够通过细胞膜上的阴离子转运蛋白将葡萄糖酸转运到细胞内，并通过葡萄糖酸激酶将其磷酸化为6-磷酸葡萄糖酸，随后将其纳入戊糖磷酸途径进行进一步代谢（Benito，2019年；Corkins、Wilson、Cocuron、Alonso和Bird，2017年）。减少或消除葡萄糖酸是有益的，因为葡萄糖酸在储存过程中可能导致乳酸菌生长，从而引发微生物不稳定。我们选择了Sp3菌株进行发酵，该菌株具有较高的葡萄糖酸消耗能力、适中的苹果酸消耗能力和较强的发酵能力，能够独立完成发酵过程（Del-Bosque等人，2025年）。实验比较了单独使用S. pombe菌株与与S. cerevisiae联合接种的结果。
酶和化学试剂
GOX（EC 1.1.3.4，来自Aspergillus niger的Gluzyme? Fortis 10,000 BG，浓度为10,000 U/g）和CAT（EC 1.11.1.6，来自A. niger的Catazyme? 25 L，浓度为25,000 U/mL）均由诺维信公司（Novozymes，丹麦Bagsvaerd）提供。LUDOX? HS-40胶体二氧化硅（420816）和硅酸钠（338443）购自西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）。藻酸钠（A3249,0250）购自Panreac Applichem公司（德国达姆施塔特）。其他化学品均为分析级，同样来自Panreac Applichem。
使用GOX-CAT胶囊对葡萄汁进行酶处理
为了降低Verdejo葡萄汁中的葡萄糖含量，我们采用了GOX-CAT胶囊进行酶处理。如表2所示，酶处理后GOX-MUST中的葡萄糖浓度降至87.1 ± 2.0 g/L，相比CT-MUST降低了17.3 ± 0.5%。这些结果与Del-Bosque、Vila-Crespo、Ruipérez、Fernández-Fernández和Rodríguez-Nogales（2023a；Del-Bosque、Vila-Crespo、Ruipérez、Fernández-Fernández和Rodríguez-Nogales，2023b）之前的研究结果一致。
结论
实验结果表明，经过48小时GOX-CAT胶囊预发酵处理的Verdejo葡萄汁中葡萄糖含量降低了17.3 ± 0.5%，潜在酒精浓度降低了1.38%（体积百分比）。这在许多酿酒厂中可以弥补全球变暖导致的平均温度升高的影响。大约90.01%的葡萄糖氧化产生的葡萄糖酸被保留在胶囊中，从而实现了对酒精浓度的适度降低。
作者贡献声明
大卫·德尔-博斯克（David Del-Bosque）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法论设计、实验设计、数据整理。约瑟菲娜·维拉-克雷斯波（Josefina Vila-Crespo）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法论设计、实验设计、数据整理、概念构建。维奥莱塔·鲁伊佩雷斯（Violeta Ruipérez）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法论设计、实验设计、数据整理、概念构建。恩卡纳西奥娜·费尔南德斯-费尔南德斯（Encarnación Fernández-Fernández）：负责撰写、审稿与编辑。
知情同意声明
所有参与研究的作者均已签署知情同意书。
机构审查委员会声明
不适用。
资金支持
本研究未接受任何外部资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
感谢Santiago Benito提供Sp3菌株，同时感谢M.A. García提供的技术支持，以及诺维信西班牙公司（Novozymes Spain, S.A.）捐赠的酶试剂。
