《Food Research International》：Ultrasound-assisted laccase covalent and non-covalent binding to lactoferrin/pea protein-proanthocyanidins: structural and functional insights
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本研究系统探究了不同LF/PPI配比对超声波辅助漆酶催化下形成的LF/PPI-PC复合系统的结构特性及功能特性，发现复合系统具有增强抗氧化能力（DPPH和ABTS清除率分别超过80%和70%）、提高热稳定性和乳化性能，以及显著改善泡沫稳定性的协同效应，其中70/30配比效果最佳。
Xinyu Zhang | Yifang Wang | Xiaolong Zhu | Maolin Tu | Yuxing Guo | Tai Zhang | Hongzhao Sun | Lianliang Liu
国家农业产品质量与安全生物化学威胁管理重点实验室，浙江-马来西亚农产品加工与营养联合研究实验室，浙江省食品微生物与营养重点实验室，宁波大学食品科学与工程学院，中国浙江省宁波市
摘要
本研究系统地探讨了不同混合比例（100/0、70/30、50/50、30/70、0/100）下乳铁蛋白（LF）和豌豆蛋白分离物（PPI）的结构特性。通过超声波辅助的漆酶介导的共价和非共价作用，LF/PPI蛋白与原花青素（PC）形成了复合物。LF/PPI的比例显著影响了蛋白质-多酚的相互作用，导致颗粒大小、ζ电位和二级结构的变化。PC的加入改变了蛋白质的构象，降低了表面疏水性，并促进了复合物的形成——这一发现通过SDS-PAGE得到了验证。共价结合的复合物表现出优异的抗氧化活性，在DPPH试验中的自由基清除效率超过80%，在ABTS+试验中超过70%，其FRAP还原能力比未修饰的蛋白质高出约3倍。这些结合物还表现出增强的热稳定性（热转变温度提高了6–16°C）和乳化活性（活性指数提高了0.6–0.75倍），表明分子间相互作用得到了加强。此外，PC的加入显著改善了LF/PPI体系的发泡能力和泡沫稳定性，其中70/30的LF/PPI比例表现最佳，其泡沫稳定性比单独使用蛋白质时提高了约30–50%。这些结果为设计混合植物-动物蛋白系统提供了新的见解，并为开发多功能蛋白质-多酚成分在食品中的应用提供了有前景的策略。
引言
随着人们对健康导向和可持续饮食的关注不断增加，开发兼具高营养价值和理想功能特性的蛋白质成分已成为食品科学的主要研究方向（Azam等人，2025年）。与单一来源的蛋白质相比，动植物蛋白复合物具有独特的结构和界面特性，从而在食品系统中表现出更优越的功能（Zamzam等人，2025年）。蛋白质-蛋白质之间的相互作用对于决定蛋白质复合物的稳定性和功能至关重要。除了直接的蛋白质-蛋白质接触外，某些小分子还可以通过诱导蛋白质表面氨基酸残基之间的空间接近来调节这些相互作用。其中，“分子桥”策略涉及小分子通过其功能基团与蛋白质表面形成非共价或共价相互作用，从而连接不同的蛋白质组分并增强复合物系统的稳定性和功能性（Guo等人，2024年）。多酚作为一种天然存在的生物活性分子，已被证明可以通过氢键、疏水相互作用和共价键来调节蛋白质-蛋白质界面行为（Nassarawa等人，2023年）。例如，多酚化合物表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）通过加强玉米蛋白和β-乳球蛋白（β-LG）之间的氢键和疏水相互作用来提高蛋白质混合物的稳定性和紧密性（Jiao等人，2025年）。
豌豆蛋白分离物（PPI）是一种代表性的植物蛋白，富含蛋白质和碳水化合物，脂肪含量低，并含有丰富的必需维生素和矿物质（Zhang, Pelosin等人，2025年）。乳铁蛋白（LF）是一种能与铁结合的动物蛋白（Fijalkowski等人，2025年）。将LF与PPI结合可以部分提高氨基酸的互补性，并通过蛋白质-蛋白质的协同效应增强蛋白质的功能性（Adal等人，2017年）。原花青素（PC）是一类天然存在的黄酮类化合物，主要聚合成由儿茶素亚单位组成的寡聚或聚合物结构（Chen, Althawab等人，2025年）。研究表明，PC可以与LF和PPI分别相互作用，并改善它们的功能特性（Dai等人，2020年；Li, Dai等人，2021年）。然而，PC在LF/PPI双蛋白系统中作为分子桥的作用，以及其在结构和功能协调调节中的作用仍不明确。
漆酶可以通过温和且环保的酶促反应高效地使蛋白质与多酚共价连接，从而增强复合物的稳定性和功能性（Babinskas & Matijosyte，2025年）。然而，传统的漆酶催化反应耗时较长，导致实际工业应用中的效率较低。超声波作为一种物理预处理技术，在食品加工行业中发挥了重要作用，可以缩短漆酶催化的反应时间并提高催化效率（Yu等人，2024年）。超声波可以通过空化效应和机械效应诱导蛋白质分子重构，改变其构象并暴露更多的潜在结合位点，从而增强蛋白质-蛋白质相互作用（Chang等人，2025年）。
本研究旨在通过结合超声波预处理和漆酶催化来构建不同LF/PPI比例的LF/PPI–PC复合物系统。以非共价结合系统作为对照，我们系统地比较了不同处理方法和蛋白质比例条件下复合物的结构和功能差异。为此，我们使用了颗粒大小和ζ电位测量、多光谱技术、SDS–PAGE、分子对接、光学显微镜、功能基团分析和表面疏水性评估等综合方法。这种方法系统地阐明了蛋白质结构变化与抗氧化能力、发泡和乳化性能以及热稳定性之间的内在关系。本研究的结果从结构-功能的角度揭示了多酚在动植物蛋白复合物中的作用机制，明确了超声波辅助漆酶策略在调节双蛋白-多酚结合方面的方法学优势，并为开发多功能双蛋白-多酚配方在可持续食品应用中的基础提供了见解。
材料
PPI（蛋白质含量：80%）来源于中国德州的禹王集团。LF（纯度：98%）来源于中国上海的Fonterra Corporation Trading Company Limited。PC（纯度≥97%）购自中国上海的Maclean Biochemical Technology Co. Ltd。漆酶（120 U/g）和十二烷基硫酸钠（SDS）由中国上海的Yuanye Biotechnology Co. Ltd.提供。本研究中使用的所有化学品均为分析级，由试剂公司提供。
颗粒大小、PDI和ζ电位
如图1A所示，随着PPI比例的增加，LF/PPI混合物的颗粒大小和多分散指数（PDI）逐渐接近纯PPI的值，表明在PPI占主导的系统中LF的作用有限（Zhao等人，2025年）。PC的加入显著增加了颗粒大小和PDI（P<0.05）。超声波辅助的漆酶处理进一步放大了颗粒的增大。例如，在LF/PPI比例为100/0时，颗粒大小增加
结论
本研究表明，LF和PPI的混合比例显著影响了双蛋白系统的结构和功能特性。通过超声波辅助的漆酶催化实现与PC的共价结合，形成了稳定的LF/PPI–PC复合物，改变了蛋白质的二级结构并降低了表面疏水性。共价交联的复合物表现出优异的抗氧化能力、增强的热稳定性和乳化稳定性，以及显著改善的发泡性能
作者贡献声明
Xinyu Zhang：撰写——原始草稿。Yifang Wang：概念构思、方法设计。Xiaolong Zhu：实验研究。Maolin Tu：数据管理。Yuxing Guo：项目管理。Tai Zhang：监督。Hongzhao Sun：数据可视化。Lianliang Liu：撰写——审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者声明他们在本研究中没有利益冲突。本研究得到了国家自然科学基金（32472329）和宁波市青年科技创新领军计划（2024QL030）以及安徽农业大学茶树生物学与利用国家重点实验室（SKLTOF20230113）的支持。
