《International Dairy Journal》：Population of Gram-negative bacilli in raw goat milk from Rio de Janeiro, Brazil: Identification and biofilm formation capacity on stainless steel
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本研究针对巴西非正规渠道生山羊奶存在的微生物污染问题，系统分析了其中革兰氏阴性杆菌的种群多样性，并通过Congo Red Agar（CRA）法和不锈钢载体定量实验评估了分离菌株的生物膜形成能力。研究发现生山羊奶中存在显著的微生物多样性，其中7株菌（包括假单胞菌属、不动杆菌属等）具有强生物膜形成能力，尤其在UHT山羊奶中生物膜细胞浓度高达7.46 log CFU/cm2。该研究为控制乳业生产链中的生物膜污染提供了关键数据支撑，对保障乳制品安全具有重要意义。
在巴西，尽管法律明令禁止销售生乳，但在许多小城镇，非正规渠道的生山羊奶交易依然普遍。这些未经加工、缺乏标签的乳制品不仅可能含有导致变质的微生物，还可能存在潜在致病菌，对消费者健康构成威胁。山羊奶本身含有丰富的微生物群落，其组成受到环境、动物皮肤和胃肠道微生物以及挤奶卫生管理实践的显著影响。特别是革兰氏阴性杆菌，如假单胞菌属（Pseudomonas）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌，因其能够在食品接触表面（如不锈钢）形成生物膜（biofilm）而备受关注。生物膜是细菌附着在生物或非生物表面形成的结构化群落，包裹在聚合物基质中，能够增强细菌对抗菌剂和常规卫生处理的耐受性，成为乳业生产中的一大挑战。
为了深入理解生山羊奶中的微生物风险，特别是其在加工设备表面形成生物膜的能力，来自弗卢米嫩塞联邦大学（Fluminense Federal University, UFF）的研究团队开展了一项系统研究。该研究旨在鉴定巴西里约热内卢州部分地区非正规渠道生山羊奶中革兰氏阴性杆菌的多样性，并评估这些微生物在不锈钢表面形成生物膜的能力及其定量特征。研究成果发表在《International Dairy Journal》上，为评估生山羊奶的安全风险和控制生产链中的生物膜污染提供了重要的科学依据。
研究人员采用了多种关键技术方法开展研究。他们从里约热内卢州的四个城市（伊塔奥卡拉、新伊瓜苏、圣安东尼奥-迪帕杜阿和圣冈卡洛）的非正规生产者处采集了8份生山羊奶样本。通过选择性培养基（VRBG、TBX和Cetrimide Agar）进行微生物的分离培养。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对分离出的菌株进行精确鉴定。采用刚果红琼脂（Congo Red Agar, CRA）法初步筛选具有生物膜形成潜力的菌株。最后，通过定量实验评估了阳性菌株在AISI 304不锈钢载体上于Luria-Bertani（LB）肉汤和UHT山羊奶中形成生物膜的能力，并对固着细胞（sessile cells）进行计数。
3.1. 分离物的鉴定和特征
研究共获得136个分离株，其中59.3%为假单胞菌属（Pseudomonas），是不锈钢表面生物膜形成的主要挑战者。其他主要菌属包括不动杆菌属（Acinetobacter, 10.2%）、土壤杆菌属（Agrobacterium, 8.5%）和克雷伯菌属（Klebsiella, 7.6%）。研究还发现了通常与选择性培养基目标不符的微生物，如革兰氏阳性菌（芽孢杆菌属Bacillus、葡萄球菌属Staphylococcus）甚至酵母菌（假丝酵母Candida parapsilosis），这表明选择性培养基并非绝对专一，高微生物负载或菌株的适应性可能导致非目标菌生长。此外，潜在致病菌如大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的检出，进一步凸显了非正规生乳贸易的风险。这些微生物多样性的存在主要归因于未能良好遵守挤奶规范（Good Milking Practices）以及销售环节缺乏冷链和卫生控制。
3.2. 生物膜产生活性
通过CRA测试，从136个分离株中鉴定出7个具有生物膜产生阳性表型的菌株，分属于假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）和土壤杆菌属（Agrobacterium）。阳性结果表现为菌落形态粗糙且呈现深黑色。这些能够形成生物膜的微生物的存在，预示着它们在乳业设备表面定植和持续污染的风险，特别是假单胞菌属能产生大量胞外聚合物（EPS），促进生物膜形成并增强对消毒剂的耐受性。不同样本间的微生物负载和物种多样性差异显著，表明污染风险与个体生产者的农业操作规范密切相关。
3.3. 不锈钢表面生物膜形成的定量评估
定量分析显示，所有测试菌株在24至48小时内均能在不锈钢表面形成生物膜，固着细胞计数在LB肉汤和UHT山羊奶中均有增长。值得注意的是，在UHT山羊奶中形成的生物膜其固着细胞计数通常高于或与LB肉汤中相当，特别是在48小时时，土壤杆菌放射土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）分离株A6-V8在UHT山羊奶中达到了7.46 log CFU/cm2的高计数，超过了7.0 log CFU/cm2的成熟生物膜阈值，显示了极强的定植能力。相比之下，克雷伯菌产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）分离株A5-V9在牛奶中的增长变化较小，可能较早达到定植平台期或受营养限制。研究表明，牛奶残留物为细菌初始粘附提供了“锚定桥”，并且一旦生物膜建立，牛奶本身可作为可再生的培养基，维持生物膜中细菌的存活和生长。此外，存在于乳制品环境中的微生物可能因牛奶残留物提供保护层而对消毒剂产生更强的耐受性。
本研究得出结论，非正规渠道的生山羊奶含有复杂且多样的微生物群落，其中多种革兰氏阴性杆菌具备在不锈钢表面形成强健生物膜的能力。这突显了加强良好挤奶规范、确保设备彻底卫生以及严格控制冷链的重要性。生物膜的发现和定量数据提高了对饮用生乳风险的认识，并为乳业生产链中生物膜的控制提供了宝贵信息，有助于构建微生物风险评估模型和制定更有效的控制策略。未来研究可进一步评估这些生物膜对乳业常用化学消毒剂的耐受性，并分析生物膜形成和清除的动力学，以优化卫生协议。
