25种市售婴幼儿配方奶粉中牛奶寡糖的全面鉴定与绝对定量分析

《International Dairy Journal》：Comprehensive Identification and Absolute Quantification of Milk Oligosaccharides in 25 Commercial Young Child Formulas

本研究通过MALDI-TOF/TOF和UPLC-MS/MS分析25种中国市售婴幼儿配方奶粉中的寡糖，鉴定出196种，其中182种为共有的，23种为牛乳原生寡糖（BMOs），155种可能来自添加的GOS/FOS。定量显示GL异构体最丰富，唾液酸化寡糖次之，2'-FL、3-FL和LNnT含量较低。该研究为婴幼儿配方奶粉的寡糖功能评估和优化提供了数据支持。

　　

韩红阳|徐新怡|汤姆·胡佩尔茨|张琳娜|周鹏

江南大学食品科学与技术学院，中国江苏省无锡市 214122

摘要

本研究全面识别并量化了中国市场上25种商业婴幼儿配方奶粉（YCFs）中的寡糖（OSs）。通过MALDI-TOF/TOF和UPLC-MS/MS技术，共鉴定出196种寡糖结构，其中182种在所有YCFs中均存在。这些寡糖包括23种天然的牛乳寡糖（BMOs），而大多数（155种结构）可能来源于添加成分，如半乳寡糖（GOS）和果寡糖（FOS）。对8种寡糖（2'-FL、3-FL、LNnT、3'-SL、6'-SL、3'-GL、4'-GL、6'-GL）进行了绝对定量分析，其含量范围为1245.4至6728.1 μg·g^-1。GL异构体（3’/4’/6’-GL）最为丰富，这与GOS的添加情况一致，其次是唾液酸化的寡糖（3’-SL和6’-SL）。相比之下，2’-FL、3-FL和LNnT的含量相对较低。明确寡糖的来源及其含量对于全面了解YCFs至关重要，有助于进行准确的功能评估和有针对性的产品改进。

引言

寡糖（OSs）是一类短链碳水化合物，通常由3到10个单糖单元组成（聚合度DP = 3-10），被认为是重要的功能性碳水化合物和可溶性纤维（Catenza & Donkor, 2021）。寡糖具有重要的生理作用，包括调节肠道微生物群、增强肠上皮细胞黏附、提高全身免疫力以及促进大脑发育（Campbell et al., 2023; W. Li et al., 2021; ?uligoj et al., 2020; Wiciński, Sawicka, G?balski, Kubiak, & Malinowski, 2020）。在从纯母乳喂养过渡到辅食（6-12个月）再到固体食物（1-3岁）的过程中，肠道生态系统和免疫系统会迅速发育和适应。在这一关键时期补充外源性寡糖有助于维持肠道健康并缓解幼儿的过敏反应（T. Liu et al., 2020）。

婴幼儿配方奶粉（YCF）是幼儿早期的重要营养来源，其寡糖组成对支持健康成长具有重要意义（Mancabelli et al., 2020）。目前，YCFs中含有的寡糖主要分为几类：首先是人乳寡糖（HMOs），如2′-岩藻糖（2′-FL）、3-岩藻糖（3-FL）和乳-N-新四糖（LNnT）。由于这些HMOs的商业可用性和已确立的安全性，它们已被批准用于婴儿和后续配方奶粉（Christensen, Skov, Lendal, & Hornsh?j, 2020; Guimar?es et al., 2019）。寡糖通过抑制肠道病原体在宿主细胞表面的附着而具有直接的抗菌作用，从而防止其定植；此外，它们还通过调节上皮细胞和免疫细胞的反应来促进免疫稳态，营造抗炎环境并支持免疫耐受性的发展（W. Li et al., 2021; Yvan Vandenplas et al., 2018）。其次是常用的传统益生元，如半乳寡糖（GOS）和果寡糖（FOS）（Barry et al., 2008; Closa-Monasterolo et al., 2013; Y. Vandenplas, 2007）。值得注意的是，GOS含有3′-岩藻糖（3′-GL）、4′-岩藻糖（4′-GL）和6′-岩藻糖（6′-GL）等结构单元，这些成分也天然存在于人乳和其他哺乳动物的乳汁中（Zhao et al., 2025）。这些成分不仅是简单的益生元，还是将经济高效的GOS材料与天然寡糖的复杂生物活性连接起来的关键桥梁（Akkerman, Faas, & de Vos, 2018）。具体而言，GOS的结构单元如3′-GL、4′-GL和6′-GL可以作为益生菌细菌的特异性底物，被其发酵产生短链脂肪酸，从而直接调节肠道微环境和生理功能（Andersen et al., 2011; Arnold, Simpson, Roach, Bruno-Barcena, & Azcarate-Peril, 2018; Goh & Klaenhammer, 2015; Theilmann, Fredslund, Svensson, Lo Leggio, & Abou Hachem, 2019）。第三类是内源性牛乳寡糖（BMOs），它们天然存在于YCF的乳基中，主要是唾液酸化的结构，如3′-唾液酸岩藻糖（3′-SL）和6′-唾液酸岩藻糖（6′-SL）。不同乳源中的这些寡糖含量有所不同；例如，3′-SL在牛乳中的含量较高，而6′-SL在人乳中更为丰富（ten Bruggencate, Bovee-Oudenhoven, Feitsma, van Hoffen, & Schoterman, 2014）。据报道，这些唾液酸化的寡糖通过增加大脑中的唾液酸和神经节苷脂含量来支持神经认知成熟（Sakai et al., 2006; B. Wang, McVeagh, Petocz, & Brand-Miller, 2018）。因此，鉴于寡糖在病原体防御、微生物群调节和神经发育中的特定作用，对其在YCF中的组成进行鉴定和量化对于确保产品功能符合这些关键目标至关重要。

近年来，多项研究对牛奶和乳制品中的寡糖进行了定性或定量分析（F. Liu, van der Molen, Kuipers, & van Leeuwen, 2023; Ma, McJarrow, & Fong, 2019b; Molnár-Gábor, Lengyel, & Krongaard, 2024; Nijman et al., 2018）。质谱（MS）被广泛用于高灵敏度的碳水化合物结构鉴定，常用的方法包括傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）、四极杆飞行时间质谱（Q-TOF）、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）（Tao et al., 2008）。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS）是寡糖表征的常用方法。在我们之前的研究中，采用了甲基化修饰来增强寡糖在质谱仪中的响应，从而能够分析8种牛奶寡糖的组成（Shi, Han, Zhang, & Zhou, 2021）。常见的寡糖定量分析方法包括高效液相色谱（HPLC）结合折射率检测（RID）、蒸发光散射检测（ELSD）或质谱检测（MS）（C. Nobre et al., 2017; Yu et al., 2018）。例如，HPLC-MS已被用于研究哺乳期间寡糖的变化，以及分析配方奶粉中的牛奶寡糖（MOS）含量（Ma, McJarrow, & Fong, 2019a; Ma et al., 2018）。同样，UPLC-FLD也被用于定量分析牛奶渗透粉和乳清粉中的BMOs，并比较了9种已鉴定BMOs的含量（Yang et al., 2022）。

然而，市面上YCFs中的寡糖组成分析仍然相对有限。此外，同时识别和量化包括MOS、FOS和GOS在内的多种寡糖的结构单元在奶粉配方中仍缺乏。例如，Nijman等人（2018）仅研究了人乳和婴儿配方奶粉中的FOS和GOS，未涉及YCFs。一项对39项临床研究的回顾表明，24项研究使用了GOS/FOS（9:1）的益生元混合物，指出不同益生元的益处取决于其具体结构，不能简单推广（Moro & Boehm, 2012）。因此，确定YCFs中的寡糖组成和浓度是评估其生物功能的前提，尤其是在向固体食物过渡的关键时期。为解决这些不足，本研究采用了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS）的组合分析方法，实现了25种商业YCFs中寡糖的广泛定性分析和广谱绝对定量。与以往的研究相比，本工作使用了PGC-SPE技术有效去除了乳糖，显著提高了寡糖的富集效率和检测准确性。此外，还采用了甲基化修饰来增强质谱响应，提高了检测灵敏度和寡糖种类的识别能力。具体而言，这项工作为大规模结构分析和多种寡糖的绝对定量提供了支持，包括内源性BMOs、添加的HMOs以及GOS/FOS衍生的结构。本研究的结果为评估YCFs的寡糖营养价值提供了科学依据，并为未来根据幼儿营养需求优化配方提供了参考。

标准品和化学品

25份YCFs样本从中国商业零售商处获得，相关样本及其详细信息可见于之前的出版物（Chen et al., 2025）。2′-FL、3-FL、3′-SL、6′-SL、LNnT、3′-GL、4′-GL和6′-GL的标准品购自GLYCOSCI（上海ZZBIO有限公司，中国）。所有试剂均为分析级或色谱级。乙腈、甲酸铵、甲酸、醋酸和异丙醇均购自Thermo Fisher Scientific（Waltham）。

寡糖的全面分析

在25份YCFs中共鉴定出196种不同的寡糖（图1）。样本1中的寡糖数量最多（143种），而样本18中的寡糖数量最少（42种）。它们的聚合度从三糖到九糖不等。与之前报道的牛乳中的30种不同寡糖（Shi et al., 2021）相比，这些结果表明YCFs中的寡糖组成更为多样，可能来源于多种潜在来源（表S1）。

结论

本研究全面分析了25种商业YCFs中的寡糖组成。共鉴定出196种不同的寡糖，其中182种在所有样本中均存在，14种仅存在于特定产品中。对8种关键寡糖的定量分析显示，它们在YCFs中的含量存在显著差异，其中半乳糖衍生物最为丰富。

作者贡献声明

韩红阳：撰写——初稿、可视化、软件应用、方法学设计、实验实施、数据分析、数据整理。徐新怡：软件应用、方法学设计、实验实施、数据分析、数据整理。汤姆·胡佩尔茨：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金筹集。张琳娜：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金筹集。周鹏：撰写——审稿与编辑、项目监督、概念构思

未引用的参考文献

Li et al., 2021; Nobre et al., 2015; Vandenplas et al., 2018; Wang et al., 2022; Wang et al., 2020a; Wang et al., 2020b.

利益冲突

汤姆·胡佩尔茨受雇于FrieslandCampina公司。本研究未与该公司存在任何可能被视为利益冲突的关系。其他作者声明没有利益冲突。资助方未参与研究的设计、数据收集与分析、手稿撰写或结果发表的决定。

利益冲突声明

?作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：汤姆·胡佩尔茨受雇于FrieslandCampina公司。本研究未与该公司存在任何可能被视为利益冲突的关系。其他作者声明没有利益冲突。资助方未参与研究的设计、数据收集与分析、手稿撰写或结果发表的决定。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFD2101504）、FrieslandCampina B.V.（A3576AQ00）以及中央高校基本科研业务费（JUSRP202416004）的支持。