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本研究发现ATG16L1蛋白通过非自噬途径调控口蹄疫病毒（FMDV）感染：促进病毒早期内吞和转运至早期内体及TGN，抑制病毒2BC蛋白的泛素化降解，并通过caspase途径维持病毒复制。该结果揭示了ATG16L1在FMDV生命周期中的双重调控机制。
Xiaohua Gong|Hong Yuan|Tao Wang|Lei Huang|Junfang Zhao|Pinghua Li|Mengting Cai|Huifang Bao|Pu Sun|Kun Li|Xueqing Ma|Yimei Cao|Yuanfang Fu|Zaixin Liu|Yang Yang|Zengjun Lu|Xingwen Bai
中国农业大学兰州兽医研究所兰州大学兽医学院动物疾病控制与预防国家重点实验室，中国兰州
摘要
高致病性口蹄疫病毒（FMDV）的整个生命周期在很大程度上取决于宿主因素以实现其感染。ATG16L1在自噬早期阶段对于形成自噬体膜是必需的，而其在FMDV感染中的非自噬作用尚不清楚。我们发现，FMDV O/Fujian/CHA/5/99进入细胞后，会通过早期内体（EEs）和跨高尔基体网络（TGN）进行转运，绕过晚期内体（LEs）和回收内体（REs）。这种特定的细胞内分布与之前报道的涉及ATG16L1的囊泡分选途径一致。进一步分析表明，ATG16L1增强了FMDV的内化并促进了FMDV感染的初始阶段。然而，ATG16L1通过其非自噬功能在高尔基体中降解FMDV的2BC蛋白，从而抑制了FMDV感染的后期阶段。为了对抗这一机制，膜相关蛋白2BC与ATG16L1相互作用，并通过半胱天冬酶途径介导其降解，从而维持FMDV的复制。总之，我们的证据表明ATG16L1在调节FMDV的生命周期中起着双重作用。
引言
口蹄疫病毒（FMDV）属于皮科纳病毒科，是一种具有正链单链RNA基因组的无包膜病毒[1]。与其他皮科纳病毒一样，FMDV感染会导致细胞膜在其整个生命周期中发生广泛的重排[2]，[3]。FMDV的生命周期包括几个独立阶段：附着、进入、脱壳、蛋白质翻译、RNA复制、组装、成熟和释放[4]，[5]。在感染初期，FMDV通过与受体整合素或肝素硫酸盐（HS）的相互作用吸附在易感细胞表面，并通过网格蛋白/ caveolin介导的内吞作用或微胞饮作用进入细胞[6]，[7]，[8]，[9]。然而，控制这些进入途径的具体膜蛋白、适配器和细胞骨架成分仍不清楚。一旦进入细胞，FMDV会被转运到早期内体（EEs），酸性环境会触发衣壳脱壳和RNA释放[10]。然而，内吞囊泡与EEs融合的精确动态尚未完全阐明。随后，释放的病毒RNA被运输到高尔基体和内质网进行蛋白质翻译和基因组复制[2]，[3]，[11]。FMDV复制周期的最后阶段是病毒颗粒的组装、成熟和释放，这些过程的具体机制尚未明确，但据认为主要依赖于宿主细胞膜[12]，[13]。
内体转运是一种基本的细胞过程，负责细胞内物质的运输和分选。它主要包括货物的定向细胞内转运和降解[14]。颗粒通过内吞途径进入细胞，并进入已存在的内体（EEs），这是主要的分选站。从EEs开始，货物被分为回收或降解途径[14]。在回收途径中，货物从EEs中被移除到囊泡载体中并返回到质膜，或被运输到高尔基体[15]。一种关键的机制是将蛋白质和脂质从溶酶体降解中转移出来，即逆向转运，它将货物从内体运输到跨高尔基体网络（TGN）[14]，[16]。相反，剩余的内体会成熟为晚期内体（LEs）并与溶酶体融合进行降解[17]。内体转运及其调节蛋白与病毒生命周期密切相关[18]，[19]。许多病毒利用这些途径来促进复制[20]，[21]，[22]。例如，乙型肝炎病毒（HBV）利用Rab5和Rab33B进行出胞[23]，[24]，而负链RNA病毒的组装需要Rab11和回收内体（REs）[25]，[26]，[27]。相反，内体转运也参与宿主的抗病毒防御[28]，例如，IFITM3调节LEs的功能以阻止呼肠孤病毒进入[29]，[30]。在感染过程中，FMDV表现出与这一系统的复杂相互作用：它利用EEs进行酸性解体，同时通过降解Rab27a来抑制抗病毒免疫[31]，[32]，[33]。这突显了FMDV在特定感染阶段差异性地调节内体转运的精妙策略。
新的证据表明，多种与自噬相关的蛋白质在病毒感染过程中独立于其自噬功能参与一个或多个事件[34]。ATG16L1是自噬体生物生成的核心成分，也在质膜融合和囊泡转运中发挥非经典作用[35]，[36]，[37]。一项研究发现，与质膜相关的ATG16L1通过网格蛋白介导的内吞作用（CME）被内化并转运到内体[38]，这一过程有助于埃可病毒7的内化[34]。此外，ATG16L1与跨膜蛋白59（TMEM59）相互作用，以调节Rab6阳性区室的细胞内转运[39]。尽管有这些发现，FMDV感染期间内体和囊泡转运的详细作用及相关机制仍大部分未知。有趣的是，我们注意到ATG16L1的生物学功能与FMDV的细胞内转运相吻合。因此，我们探索并确认了ATG16L1通过非自噬机制在调节FMDV感染中的功能作用。
章节片段
细胞和病毒
BHK-21（中国典型培养物中心；GDC010）和HEK293-T（美国典型培养物中心，CRL-11268）细胞在含有10%胎牛血清（FBS，Gibco）和2 mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco）中培养。这两种细胞系均无支原体污染，并在37°C和5% CO2条件下培养。O/Fujian/CHA/5/99是一种适应细胞环境的泛亚洲FMDV株，于1999年从中国福建省的猪身上分离出来[40]。在BHK-21细胞中传代十次后...FMDV O/Fujian/CHA/5/99在BHK-21细胞中的内化和内体转运
先前的研究表明，FMDV的受体利用与其血清型和毒株有关，导致病毒的内化途径和细胞内转运存在差异。我们首先研究了本研究中使用的FMDV O/Fujian/CHA/5/99在BHK-21细胞上的受体利用情况（图1 A-B）。肝素（HP）敏感性测试表明，预孵育HP几乎无法减少O/Fujian/CHA/5/99产生的斑块数量。相反...
讨论
皮科纳病毒感染会诱导与自噬途径、内体分泌途径和高尔基体运输相关的囊泡结构的形成，这些结构为病毒复制提供了平台[3]，[47]。内体转运贯穿整个病毒生命周期[19]。FMDV感染还显著依赖于细胞内多种调节蛋白参与的内体和囊泡转运及融合[9]，[32]，[48]，其中许多调节蛋白尚未被识别。ATG16L1是...
CRediT作者贡献声明
Xiaohua Gong：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理。Hong Yuan：撰写——审阅与编辑、方法学、正式分析。Tao Wang：方法学。Lei Huang：方法学。Junfang Zhao：方法学。Pinghua Li：资源准备。Mengting Cai：方法学。Huifang Bao：方法学。Pu Sun：资源准备。Kun Li：软件、方法学。Xueqing Ma：方法学。Yimei Cao：资源准备。Yuanfang Fu：方法学。Zaixin Liu：资金获取。Yang Yang：撰写——审阅与编辑。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：报告了存在专利申请的情况。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（[项目编号：2021YFD1800300]）、国家自然科学基金（[项目编号：31772763, 32200136]）、甘肃省重大科技专项（[项目编号：21ZD3NA001, 22ZD6NA012, 22ZD6NA001]）以及国家生猪技术创新中心项目（[项目编号：NCTIP-XD/C03]）的支持。
