循环置换工程提高了Bst DNA聚合酶的扩增效率

《International Journal of Biological Macromolecules》：Circular permutation engineering improves amplification efficiency of Bst DNA polymerase

环状排列优化Bst DNA聚合酶性能及其与RecA协同检测策略研究。通过环状排列改造Hp47-Sto7d域，构建四株CP-Bst突变体，发现CP-G23突变体表面疏水性改变显著提升DNA结合亲和力，在45分钟内可检测10? copies/μL病毒DNA和0.01 pg/μL SARS-CoV-2 RNA，同时简化引物设计并避免逆转录酶需求。

　　

荣翔|刘光义|王彦茹|侯毅|胡松青

华南理工大学食品科学与工程学院，广州，510640，中国

摘要

先前，通过引入Hp47-Sto7d结构域，构建了一种具有高抑制剂耐受性和逆转录酶活性的嵌合Bst DNA聚合酶（HpStBL）。然而，复杂的引物设计以及环介导等温扩增（LAMP）中的非特异性扩增可能性，限制了HpStBL在核酸检测中的广泛应用。为了探索性能更优的聚合酶以用于LAMP和逆转录LAMP（RT-LAMP），通过对HpStBL的Hp47-Sto7d结构域进行环状置换，生成了四种CP-Bst DNA聚合酶突变体。结果表明，环状置换通过改变氨基酸序列影响了蛋白质的疏水性，从而影响了聚合酶对DNA的亲和力，这些突变体同时表现出DNA合成和逆转录酶活性。其中CP-G23突变体表现出最高的扩增性能，能够成功扩增10^0拷贝/μL的Astroviruses质粒DNA。基于CP-G23，开发了一种简单快速的核酸检测方法，该方法利用来自Thermus thermophilus的重组酶，在45分钟内仅用一对内引物即可扩增10^0拷贝/μL的Astroviruses质粒DNA和0.01 pg/μL的SARS CoV-2 RNA。该方法简化了引物设计，无需逆转录酶，可用于定量或定性DNA/RNA检测，在临床诊断中具有显著潜力。

引言

近年来，由于环介导等温扩增（LAMP）具有高灵敏度、操作简单和检测时间短等优点，已在临床和工业诊断中得到广泛应用[1]。LAMP系统由四个特制的引物组成，这些引物覆盖目标序列的六个区域，并依赖于Bst DNA聚合酶的链置换活性，在恒定温度下引发新链的合成，从而提高目标序列的扩增效率[2]。然而，复杂的引物设计也是限制LAMP应用的因素之一，因为多个引物之间容易形成二聚体，导致非特异性扩增，因此需要考虑引物之间的距离、引物的二级结构（自二聚化和交叉二聚化）以及Tm平衡[3],[4]。异源二聚体或自二聚体引物之间的相互作用也会导致非特异性扩增，产生假阳性结果[5]。因此，简单的引物组成可以提高LAMP结果的特异性并避免假阳性信号。

目前，为了克服LAMP的缺点，已经基于Bst DNA聚合酶开发了多种等温核酸扩增方法[6],[7]。然而，大多数现有的核酸扩增检测方法只能检测到10^2–10^3拷贝的目标DNA，因此提高反应灵敏度对于即时诊断至关重要[8]。有趣的是，Bsm DNA聚合酶与RecA和pfu DNA聚合酶结合使用时，可以在30分钟内成功扩增10^8拷贝/μL的DNA目标[9]。虽然Thermus thermophilus的RecA（TthRecA）减少了LAMP系统所需的引物数量，但Bsm DNA聚合酶的催化能力较低，导致含有Bsm DNA聚合酶和TthRecA的系统的扩增效率较低[10]，并且由于反应中存在多种酶，条件更为严格[11]。通过增加组成酶之间的正向和适当相互作用并保持酶的相对比例，可以提高反应的速度和准确性[12]，因此有必要开发能够有效与RecA结合的聚合酶。

Bst DNA聚合酶是LAMP反应的核心成分，来源于Geobacillus stearothermophilus，具有优异的链置换特性，可以催化5′-3′ DNA聚合，但缺乏5′-3′外切酶活性[13]。研究表明，Bst DNA聚合酶具有弱的逆转录酶活性，能够以与禽髓细胞白血病病毒逆转录酶相同的效率合成65个核苷酸的cDNA，但在较长模板上的逆转录效果较差[14]。在之前的研究中，将Hp47-Sto7d双结构域融合到Bst DNA聚合酶大片段（Bst LF）的氨基（N）末端，构建了重组酶（HpStBL），该酶在含有1%（v/v）粪便样本的试管中可以直接扩增0.5 pg/μL的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS CoV-2）RNA[15]。然而，由于引入了强DNA结合蛋白Sto7d，HpStBL的高DNA亲和力可能导致其与RecA竞争底物DNA[16],[17]。因此，为了提高简便性和特异性，需要构建一种能够与RecA有效结合而不影响扩增能力和逆转录酶活性的Bst DNA聚合酶。

环状置换（CP）是一种蛋白质序列重排现象，其中蛋白质的N端和羧基（C）端可以在假想环状序列的不同位置生成[18]。这一现象最初在天然存在的植物凝集素蛋白favin和concanavalin A中被发现，并自1983年起启发研究人员在体内设计和合成人工CP蛋白[19],[20]。值得注意的是，CP可能会改变蛋白质的折叠机制和结构稳定性，但突变体通常保留了天然结构和生物功能[21]。近年来，CP已成为探究蛋白质结构和功能的新方法，以及提高蛋白质稳定性、溶解性和活性的生物工程技术[22]。然而，实现CP比传统的突变方法更为困难、昂贵且耗时，尤其是并非所有位置都适合进行CP改造[23]。

为了构建正确折叠且稳定的CP突变体，开发了一种CP预测工具（CPred），利用分布计算技术搜索创建新蛋白质（CP位点）的内部允许位点[24]。在获取蛋白质的三维（3D）结构后（来自蛋白质数据库PDB），会输出所有目标残基的便利概率分数（CP分数），范围在0到1之间，这有助于用户选择合适的CP位点（创建新末端的位点）[25]。CP分数通常通过基于结构衍生的残基测量和属性的三种成熟机器学习技术获得，如接近度、质心距离测量、加权接触数和远距离测量，研究发现CP分数>0.7的突变体保持了天然折叠和酶功能[26]。有趣的是，CP位点在结构和氨基酸残基上表现出一定的偏好，通常位于无序的二级结构（如螺旋、环、转角）中，或者暴露在溶剂中、氢键较弱、结构松散或灵活的残基上，特别是Gly、Pro、Asp和Asn等残基[27]。

本文设计并构建了一组CP-Bst DNA聚合酶突变体，以开发一种结合TthRecA和Bst DNA聚合酶的简单高效核酸扩增策略。选择了Astroviruses（Ast）质粒DNA、非洲猪瘟（ASFV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS CoV-2）RNA作为对象，分别研究CP-Bst DNA聚合酶突变体在LAMP和逆转录等温扩增（RT-LAMP）反应中的扩增性能。最终，基于合适的CP-Bst DNA聚合酶突变体（CP-G23），开发了TthRecA辅助的CP-Bst DNA聚合酶突变体（RCBP）系统，并对其核酸检测性能进行了评估。

章节片段

CP-Bst DNA聚合酶突变体的构建

为了修改HpStBL的扩增能力，避免其与RecA竞争核酸模板，基于鸡绒毛蛋白头部的Hp47结构域和Sulfolobus tokodaii的Sto7d结构域进行了CP改造（Hp47-Sto7d结构域的氨基酸序列列于表S1中）。Sulfolobus solfataricus的Ssod7d结构域也与Sto7d属于同一类7-kDa DNA结合蛋白家族。由于它们具有高度同源性，仅存在某些差异

CP-Bst DNA聚合酶突变体的设计、筛选和表达

先前的研究已经验证，当CP位点不是蛋白质折叠或功能所必需的残基时，突变体的生物功能不会受到影响[38],[39]。为了探索与RecA配合使用时具有更高扩增性能的合适Bst DNA聚合酶，通过对嵌合蛋白（HpStBL）的Hp47-Sto7d结构域进行CP改造来重新排列其二级结构。根据Hp47的结构，G23、M24、T25、L32和P33残基位于环状区域

结论

本文设计并构建了四种CP-Bst DNA聚合酶突变体，利用CP结合TthRecA和Bst DNA聚合酶，开发了一种简单高效的核酸扩增策略。结果表明，在G23位点构建的嵌合蛋白（CP-G23）通过改变其表面疏水性和对底物的亲和力提高了DNA聚合酶的扩增能力，但二级结构的改变也降低了其热稳定性

CRediT作者贡献声明

荣翔：撰写——原始草稿、验证、软件、方法学、研究、数据分析、数据整理。刘光义：撰写——审稿与编辑、验证、资源获取、方法学、概念化。王彦茹：撰写——审稿与编辑、验证、方法学。侯毅：撰写——审稿与编辑、资源获取、数据分析。胡松青：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目资助。

资助

本研究得到了广东省基础与应用基础研究基金会（资助编号：2021A1515220141）的支持。

利益冲突声明

作者声明与本手稿无关的任何财务利益冲突。