从桉树曲霉（Aspergillus eucalypticola）中提取的葡萄糖氧化酶经过分子修饰后，其催化活性得到提升，同时抗菌能力也得到了优化

《International Journal of Biological Macromolecules》：Molecular stabilizing a glucose oxidase from Aspergillus eucalypticola with improved catalytic activity and optimized antimicrobial capacity

通过实验室进化优化了Aspergillus eucalypticola来源的葡萄糖氧化酶（GOX），获得高热稳定（T50+13℃）和催化活性（提高97%）的突变体M1（Q148K/H283Y），其抗菌IC50显著降低（52.5%-70.5%），优于传统抗生素。

　　

Jing Li|Ying-Zhi Peng|Jian-Qiang He|Xiao-Lu Zhu|Marriam Khurshid|Shu-Biao Yuan|Kun Meng|Shuai You|Sheng-Jun Wang

中国江苏省镇江市江苏大学附属医院肾脏病科，212001

摘要

葡萄糖氧化酶（GOX EC.1.1.3.4）特异性地催化β-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸的反应，这一过程消耗氧气，使其具有抗菌潜力。然而，FAD依赖性的二聚体结构不稳定且活性不足，限制了其抗菌能力。本研究选取了来自Aspergillus eucalypticola的GOX（AeGOXL），该酶具有优异的催化效率，并通过随机突变进行实验室进化。经过筛选，获得了三种耐热变体Q148K、H283Y和P514K，它们组成的组合变体Q148K/H283Y（M1）在耐热性（T₅₀提高13°C，T_m提高6.7°C，80°C时的t_1/2延长2.1倍）和催化活性（比野生型提高97%和57%）方面均表现出优越性。结构分析表明，额外的氢键网络的形成增强了分子的稳定性，同时长程相互作用提高了关键残基的灵活性，从而提升了底物亲和力。在抗菌效果方面，M1使金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的半数抑制浓度（IC₅₀）分别降至21.3 mg/L和17.4 mg/L（比野生型低52.5%和70.5%），这一结果与电子显微镜观察结果一致。本研究探索了基于GOX功能的抗菌方法，提供了一种更温和、更环保的抗菌解决方案。

引言

葡萄糖氧化酶（GOX，EC 1.1.3.4）是一种黄素酶，其非共价辅基为黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）[1]。在催化过程中，FAD作为电子载体，促进β-D-葡萄糖的氧化，生成D-葡萄糖酸内酯和H₂O₂（图1）[2]、[3]。这些独特的生化特性使得GOX在多个工业领域得到广泛应用[4]。例如，在食品工业中，GOX可以通过消耗葡萄糖和氧气，延缓新鲜虾和果汁在加工和储存过程中的美拉德反应引起的褐变。此外，GOX产生的局部缺氧环境可以抑制需氧微生物的生长和繁殖[5]。这种替代抗生素的潜力使其成为一种有前景的饲料添加剂，有助于改善动物肠道健康并减少抗生素滥用[6]。对于某些患者来说，尤其是在感染风险较高或无法代谢抗生素的情况下，GOX替代抗生素尤为重要，因为这些患者可能需要频繁使用抗生素，从而导致更多副作用[7]。因此，提高GOX的抗菌性能具有重要意义。

GOX广谱抗菌效果的核心机制与其催化过程密切相关。副产物H₂O₂具有强氧化性，直接发挥杀菌作用。此外，葡萄糖酸的积累会降低局部pH值，破坏细菌细胞膜的质子梯度，干扰能量代谢，抑制对pH敏感的病原体（如大肠杆菌），同时增强H₂O₂的氧化能力[4]。尽管具有这些潜力，但现有GOX的抗菌效果仍不理想，主要是由于酶活性不足。作为FAD依赖性的二聚体，GOX的催化活性容易受到三级结构变化的影响，尤其是FAD解离时，这在恶劣条件下会成为一个更大问题[2]。这种脆弱的结构与高效抗菌特性相悖，因为高效抗菌需要保持活性以在酸性环境中产生更多H₂O₂。因此，要优化GOX的抗菌性能，必须同时提高其催化效率和分子稳定性[5]。

目前市面上的商业GOX主要来源于丝状真菌，尤其是Aspergillus niger和Penicillium amagasakiense。与Penicillium来源的GOX相比，Aspergillus来源的GOX通常具有更好的结构稳定性，表现为更低的热变性阈值和热处理后的功能保留[4]、[5]。然而，这些GOX在环境条件变化下仍易发生显著降解。在催化性能方面，Aspergillus来源的GOX的催化效率（k_cat/K_m）低于Penicillium来源的GOX[8]。这些固有限制需要开发兼具耐热性和催化效率的新生物催化剂。传统的稳定化方法往往会降低而非增强催化活性[9]、[10]，这也是蛋白质工程面临的关键挑战。

目前，葡萄糖氧化酶已在医学领域用于治疗糖尿病足溃疡[5]，但对其抗菌性能改进的研究较少。我们团队之前优化了Penicillium amagasakiense来源的GOX，并成功提升了其抗菌效果[11]。在本研究中，我们从Aspergillus eucalypticola中克隆了一个GOX基因（GenBank登录号：XP_025385763），并在Pichia pastoris中过表达经过密码子优化的AeGOXL基因，获得了AeGOXL蛋白。新表达的GOX表现出比大多数Aspergillus来源的GOX更好的催化活性。为了进一步提高AeGOXL的分子稳定性和催化性能，我们采用随机突变与组合定向改造相结合的方法进行了蛋白质工程。高通量筛选确定了三个有效突变（Q148K、H283Y、P514K），这些突变增强了分子的稳定性（表现为耐热性的提升）并保持了活性。进一步测试表明，组合突变体M1在活性和分子稳定性方面都有所改善，从而提高了H₂O₂的产生量，降低了pH值，并增强了了对细菌的抑制作用。对最佳突变体的结构分析揭示了影响酶稳定性和抗菌功能的结构因素（图2A）。实验结果表明，该突变体的抗菌效果优于某些抗生素（如Ampicillin对金黄色葡萄球菌；Gentamycin sulfate对大肠杆菌），为GOX的抗菌性能改进提供了实践经验和理论依据。

试剂、菌株和载体

FastPfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶（EcoRI、NotI和BglII）以及T4 DNA连接酶购自Vazyme Biotech（中国南京）和TaKaRa（日本）。pPIC9质粒和感受态Escherichia coli DMT细胞分别来自Tsingke Biotechnology（中国北京），用于克隆和质粒扩增。P. pastoris GS115菌株（Invitrogen，美国）作为GOX异源表达的宿主。

变体生成及优势突变体的鉴定

P. pastoris表达系统具备良好的真核蛋白加工和修饰能力[22]。传统的阳性转化体筛选方法依赖于培养上清液的活性检测，这一过程耗时且效率低下[23]。为克服这一限制，我们开发了一种基于固体平板的GOX活性检测方法[24]。在此基础上进一步改进，形成了便捷的

结论

本研究利用易出错的PCR技术生成了来自野生型葡萄糖氧化酶AeGOXL的催化增强突变体M1，以探索其潜在的抗菌潜力。结果表明，工程化后的M1在耐热性和催化活性方面均表现出显著提升。结构分析表明，突变导致形成了额外的氢键网络，从而增强了耐热性。

CRediT作者贡献声明

Jing Li：撰写初稿、资金获取、数据整理。Ying-Zhi Peng：方法设计、数据分析。Jian-Qiang He：指导、资源提供。Xiao-Lu Zhu：方法设计、实验实施、数据整理。Marriam Khurshid：撰写初稿、结果验证。Shu-Biao Yuan：数据可视化、软件应用。Kun Meng：方法设计。Shuai You：撰写初稿、资源提供、资金获取、概念构思。Sheng-Jun Wang：指导、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。

致谢

作者感谢镇江市科技创新资助项目（SH2023013）、江苏省研究生研究与实践创新计划（KYCX22_3854）、江苏省自然科学基金（BK20241862）以及饲料生物技术重点实验室开放项目的支持。