对转谷氨酰胺酶介导的C-藻蓝蛋白自交联机制的深入理解：这种结构强化作用提升了其在酸性条件下的紫外线稳定性

《International Journal of Biological Macromolecules》：Mechanistic insights into transglutaminase-mediated self-crosslinking of C-phycocyanin: Structural reinforcement underlying enhanced UV-light stability in acidic conditions

蓝藻蛋白C-PC通过转谷氨酰胺酶（TG）自交联修饰可显著提升光稳定性，优化条件（7U/g，pH5.0，0.5h）使褪色率降低70%，机制为形成紧凑蛋白网络包裹色素分子，抑制光氧化和聚集。

　　

王一轩|朱月明|李颖|王书军

中国天津市天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室，300457

摘要

C-藻蓝蛋白（C-PC）是一种从螺旋藻中提取的天然蓝色色素蛋白，在饮料和功能性食品中作为合成染料的环保替代品具有广泛的应用潜力。然而，其较差的光稳定性——表现为在光照下快速褪色和沉淀——严重限制了其工业应用。本研究开发了一种基于转谷氨酰胺酶（TG）的酶促自交联策略，制备了TG修饰的C-PC（TG-PC），这种策略不同于以往的复合交联方法。在该系统中，蛋白质骨架通过分子内的ε-(γ-谷氨酰)-赖氨酸键形成交联，从而在不添加额外稳定剂的情况下保护内部色素。在模拟饮料条件（pH 3.0）和紫外线照射下，TG-PC的色泽保持能力比天然C-PC高出约70%。结构分析表明，TG催化的交联使蛋白质结构更加紧凑且构象受限，有效保护了色素免受光氧化损伤，并抑制了光诱导的展开、疏水残基的暴露和聚集。圆二色性（CD）和电泳实验进一步证实，TG交联保持了α-螺旋结构，并减少了亚基的光降解，揭示了通过骨架刚性化实现稳定化的分子机制。与卡拉胶或乳清蛋白复合物相比，TG催化的修饰在酸性条件下具有更好的光保护效果，且不改变产品的成分和质地。这项工作为藻胆蛋白的酶辅助稳定化提供了机制和技术框架，为在酸性和光敏感食品系统中扩展天然蓝色色素的用途提供了一种环保且符合工业标准的策略。

引言

C-藻蓝蛋白（C-PC）是一种蓝色的水溶性色素蛋白，主要来源于Limnospira platensis（通常称为螺旋藻）[1]和其他蓝细菌。它由α和β亚基组成，这些亚基含有共价结合的开放链四吡咯色素藻蓝蛋白（PCB），进一步组装成稳定的三聚体和六聚体，形成更高阶的超分子结构[2]。由于其鲜艳的蓝色、高营养价值以及已证实的抗氧化、抗炎等生物活性[3]，[4]，C-PC在食品、营养保健品和药品领域受到了广泛关注[5]，[6]，[7]。随着消费者对“环保标签”和天然色素的偏好日益增加，C-PC被视为合成蓝色染料的理想替代品[8]。

然而，由于C-PC对食品加工和储存过程中的酸性条件及光照极为敏感，其工业应用仍然受到限制。在酸性饮料（例如pH 3.0）中，C-PC容易发生二级结构的部分展开，导致嵌入的色素构象变形并迅速褪色。展开后疏水残基的暴露进一步促进分子聚集和沉淀[1]。这些降解过程在食品运输和储存过程中在可见光和紫外线的作用下会加速。当暴露于可见光或紫外线时，C-PC会作为光敏剂产生活性氧（ROS），包括单线态氧（¹O₂）、超氧阴离子自由基（O₂^•–）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（•OH），这些物质会攻击吡咯环和肽链，导致不可逆的漂白和功能丧失[9]，[10]。

为了缓解这些降解过程，主要采用了两种稳定策略。第一种是添加抗氧化剂，如儿茶素[11]，[12]或抗坏血酸[13]，以清除光氧化过程中产生的ROS。第二种是通过与生物聚合物（如多糖、蛋白质[14]和微胶囊壳[15]）的复合作用提供静电或空间屏蔽。这些材料确实可以抑制C-PC的聚集，但往往会增加配方复杂性、改变产品质地并提高制造成本。例如，Zhang等人[14]报告称，在中性及微酸性pH（5.0–7.0）下，C-PC与ι-卡拉胶（ιCG）和乳清蛋白分离物（WPI）的复合物提高了其光稳定性；然而，在更强的酸性条件下（pH低于4.0，通常为饮料环境），这些复合物反而加速了沉淀和光漂白，且ιCG导致颜色从蓝色变为绿色。

因此，迫切需要一种温和、食品级且高效的稳定策略，能够在酸性和光氧化条件下增强C-PC的结构和颜色稳定性，而不依赖于配方级别的添加剂。转谷氨酰胺酶（TG；EC 2.3.2.13）是一种天然存在的酶，广泛用于食品加工[16]，可催化蛋白质或肽中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团与赖氨酸残基的ε-氨基基团之间的共价交联[17]。TG介导的修饰已被广泛用于提高食品成分的热稳定性、乳化能力和凝胶性能。重要的是，TG已被批准为食品级加工酶，TG交联的蛋白质已广泛应用于商业乳制品、肉类和植物性食品中，具有长期的安全食用历史。TG交联的食品蛋白质通常表现出对极端pH值、加热和酶水解等不利环境的更好抵抗力[18]，[19]，[20]。例如，Wang等人[18]报告称，在pH 5.0下对乳清蛋白进行TG处理显著提高了其回收效率和结构韧性；Li等人[19]证明TG交联在pH 7.0下增强了豌豆蛋白分离物的凝胶性能；M. Dondero等人[20]通过微生物TG有效改良了牛肉蛋白的凝胶特性。典型的反应参数包括酶浓度1–500 U/g、温度30–50°C和反应时间0.5–2小时，非常适合对敏感蛋白质进行食品级修饰。TG交联的主要优点在于其温和的操作条件（中性至微酸性pH值、30–50°C）、监管认可度，以及形成的天然存在的、可消化的ε-(γ-谷氨酰)-赖氨酸异肽键，且不引入外来化学基团[21]，[22]，[23]。尽管TG在食品蛋白质中有广泛应用，但很少用于稳定C-PC等色素蛋白，因为C-PC的光氧化不稳定性主要是由于色素周围蛋白质骨架的构象破坏，而不是表面变性。

此外，TG形成的异肽键在结构上类似于蛋白质中天然存在的键，并且可以被胃蛋白酶和胰蛋白酶等胃肠道蛋白酶消化。先前对TG交联食品蛋白质（如乳清蛋白、大豆蛋白或豌豆蛋白）的研究表明，这种修饰既不会显著改变蛋白质的消化性，也不会引入有毒代谢物[21]，[22]，[23]。此外，TG酶还被用于将C-PC与胶原蛋白交联，形成具有增强机械和生物功能的复合水凝胶，特别是在生物医学应用（如伤口愈合）中，为C-PC相关系统的共价修饰提供了对比参考[24]。例如，Wang等人[18]显示TG处理的乳清蛋白保持了高消化性，而Li等人[19]报告称交联的豌豆蛋白的功能没有受到不良影响。

在此背景下，本研究旨在建立一种TG催化的分子内自交联方法，以增强C-PC的蛋白质骨架。这种酶促修饰旨在创建一个封闭的共价网络，将藻蓝蛋白色素封装在稳定的疏水微环境中，从而在不改变配方成分的情况下保护其免受酸性和光诱导的降解。为此，系统优化了反应条件（酶剂量、pH值、时间和失活方法），并对所得到的TG修饰的C-PC（TG-PC）进行了分子结构、光稳定性、溶解性和物理化学行为的表征。此外，提出了一个机制框架，将分子内交联与增强的螺旋稳定性和降低的ROS敏感性联系起来，为了解藻胆蛋白在应力条件下的结构-功能关系提供了新的见解。总体而言，这项研究介绍了一种绿色、可控且无需添加标签的酶促修饰方法，用于提高天然蓝色色素的稳定性，将基础蛋白质化学与实际食品应用相结合，为在酸性和光敏感食品中扩展C-PC的工业用途提供了可持续的策略。

材料

来自Limnospira platensis的C-PC冻干粉购自浙江的Binmei Biotechnology公司，市售的食品级C-PC并非完全均匀。C-PC溶液的纯度比为2.5，通过测量620 nm（C-PC的特征吸收峰A620）与280 nm（包含其他藻胆蛋白和连接蛋白的总蛋白质成分A280）的吸光度比来确定[25]。较高的纯度比反映了...

酶浓度和反应时间的优化

TG交联产生的ε-(γ-谷氨酰)-赖氨酸异肽键会导致C-PC中游离氨基含量的减少[17]，[42]，因此可以将其作为共价键形成的指标。根据第2.4节所述的方法，在340 nm处使用OPA方法测定了游离氨基含量，不同酶浓度和反应时间的结果如图1所示。

对于用0–350 U/g TG处理的样品，游离氨基含量迅速下降

结论

本研究提出并验证了一种通过TG催化的分子内修饰来增强C-PC稳定性的新型酶促自交联策略。优化的反应条件（7 U/g TG，pH 5.0，0.5 h）生成了ε-(γ-谷氨酰)-赖氨酸共价键，形成了一个紧凑且有弹性的蛋白质网络，有效封装了藻蓝蛋白色素。这种环保的酶辅助方法克服了C-PC固有的酸性和光敏感性...

CRediT作者贡献声明

王一轩：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，实验研究，数据分析，概念构思。朱月明：数据分析。李颖：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。王书军：撰写 – 审稿与编辑，方法学研究，资金申请。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号32402028）的支持。我们感谢天津科技大学现代分析技术研究中心提供的数据收集设施。