《International Journal of Biological Macromolecules》：Comprehensive expression and haplotype analyses of the GDSL-type esterase/lipase (GELP) gene family provides targets for enhancing seed oil content in
Brassica juncea
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本研究系统鉴定了U型三角体六种芥属植物中GELP基因家族，发现芥菜中215个GELP基因，并通过转录组分析揭示其与种子发育及油分积累密切相关，特别是13个SFAR基因在种子成熟期高表达。SNP分析筛选出4个优质等位基因组合，显著提升芥菜种子含油量6-9%，为分子育种提供新策略。
作者：Lakshay Goyal、Shubhashree Pradhan、Shivani Gajbhiye、Aryan Vashisht、Riya Verma、Sivasubramanian Rajarammohan
印度旁遮普邦Mohali的National Agri-Food and Biomanufacturing Institute (NABI)，邮编140 306
摘要
GDSL型酯酶/脂肪酶（GELPs）是一个具有广泛底物特异性的多基因家族，参与植物的重要生长和发育过程。尽管已在多种单子叶和双子叶植物中对其进行了研究，但在关键油料作物Brassica juncea中的鉴定和分析尚未报道，且U型三角区域内的六个物种之间也缺乏比较分析。本研究在B. juncea中鉴定了215个GELPs基因，在U型三角区域的六个物种中鉴定了1126个GELPs基因。系统发育分析将这些基因分为四个主要分支（I、II、III、IV）和若干亚分支。利用B. juncea的公共转录组数据集进行分析后发现，超过65%的GELPs基因表达，其中许多基因在种子中表现出特异性表达模式。值得注意的是，一些参与种子成熟过程中脂肪酸降解的GELPs被称为种子脂肪酸还原酶（SFARs）。在B. juncea中鉴定出13个SFAR基因，并将其分为三个主要系统发育分支。基于qRT-PCR分析，BjuSFAR2、BjuSFAR3和BjuSFAR4在芽和种子中的表达水平显著高于在叶和荚果组织中的表达水平。单倍型分析发现，四个SFAR基因（Bju.SFAR2.A04、Bju.SFAR4.A06a、Bju.SFAR4.A06b、Bju.SFAR1.B06）与B. juncea的油脂含量增加有关，使其油脂含量提高了6–9%。多个高油脂含量的B. juncea品种与这些单倍型呈正相关，这表明它们在单倍型育种中具有潜在应用价值。本研究全面揭示了Brassicaceae植物中GELP基因家族的特征，并为通过基于单倍型的育种和/或基因编辑来提高B. juncea的油脂含量提供了理论依据。
引言
脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一类广泛存在于植物、动物和细菌界的脂肪分解酶。除了典型的信号肽外，这些酶还具有由丝氨酸残基组成的活性中心。根据催化结构的不同，脂肪酶可分为两个亚家族：一类含有Gly-X-Ser-X-Gly（GXSXG）基序，另一类含有Gly-Asp-Ser-Leu（GDSL）基序[1]、[2]。GDSL型酯酶/脂肪酶（GELPs）属于含有GDSL基序的水解/脂肪分解酶亚家族。在这些脂肪酶中，活性位点的丝氨酸位于N端附近，且多肽链中分布着四个保守的序列块[3]、[4]。其催化位点的结构灵活性使得GELPs具有广泛的底物特异性，能够水解多种脂质底物，如硫酯、芳基酯和磷脂[3]。
在植物中，GELPs参与了多种生物过程，包括生长、发育、代谢以及对生物和非生物胁迫的响应[5]。GELPs的功能多样性得益于其广泛的底物特异性和动态表达模式。这些酶参与调控植物的营养生长和生殖过程。例如，ZmMs30属于GELP基因家族，对玉米的雄性生育能力至关重要[6]；类似地，Brassica rapa中的细胞外脂肪酶6对花粉发育也是必需的[7]。此外，GELPs还参与角质层的形成和降解以及防御机制。在Arabidopsis thaliana中，GELP基因家族的成员能够调节对Alternaria brassicicola [8]、[9]和Alternaria brassicae [10]的免疫反应。此外，GELPs还参与脂质代谢，尤其是在种子油脂积累方面。种子油脂含量（SOC）是油料作物中具有高度经济价值的重要农艺性状。种子发育过程中的油脂积累是脂质生物合成与分解之间动态平衡的结果，而不仅仅是生物合成。脂肪酶通过其水解作用将三酰甘油（TAGs）分解为游离脂肪酸。在Arabidopsis和Brassica napus中，一些GELPs被归类为种子脂肪酸还原酶（SFARs），因为它们能促进种子TAGs中的脂肪酸释放[11]、[12]。GELP基因在多种植物物种中形成多基因家族，已在水稻[13]、Brassica rapa [14]、Arabidopsis [5]、Brassica napus [11]、葡萄[15]、大豆[16]、Daspyrum vilosum [17]、烟草[18]、番茄[19]、棉花[20]和鸽豌豆[21]等物种中被鉴定和表征。
在Brassicaceae科中，Brassica属包含多种用于生产油料、蔬菜、调味品和饲料的重要作物[22]。Nagaharu于1935年提出的经典遗传模型（U型三角模型）有助于理解主要栽培Brassica物种之间的进化关系。该模型包括三个二倍体物种：B. rapa（AA，2n = 20）、B. nigra（BB，2n = 16）和B. oleracea（CC，2n = 18），以及三个四倍体物种：B. juncea（AABB，2n = 36）、B. napus（AACC，2n = 38）和B. carinata（BBCC，2n = 34），这些四倍体物种是由二倍体自然杂交产生的[23]、[24]、[25]。Brassica juncea（印度芥菜）在东南亚、澳大利亚和印度次大陆广泛种植，既可作为油料作物也可作为蔬菜作物。尽管在理解B. juncea的油脂生物合成和积累的遗传调控方面取得了显著进展，但尚未系统地鉴定GELPs及其在种子油脂调节中的作用。此外，由于六个Brassica物种的高质量基因组数据直到最近才获得，因此也尚未对其GELPs进行比较基因组分析。
本研究利用这些基因组资源，对U型三角区域内的多个物种进行了GELPs的全基因组分析。在研究中，我们在三个四倍体物种B. carinata、B. juncea和B. napus及其三个二倍体祖先B. rapa、B. nigra和B. oleracea的基因组中鉴定了GELPs并对其进行了表征。研究内容包括系统发育关系、基因块同线性以及启动子顺式调控元件的详细分析。此外，我们还根据序列同源性和种子相关组织中的表达谱，在B. juncea中鉴定了13个AtSFAR基因的直系同源物（BjuSFAR）。此外，利用全基因组单核苷酸多态性（SNP）数据检测出与种子油脂含量增加相关的BjuSFAR优势单倍型，以辅助基于单倍型的育种，从而提高B. juncea的油脂含量。
序列搜索与GELP基因的鉴定
我们以A. thaliana为参考，鉴定了U型三角区域内所有六个物种中的GDSL型酯酶/脂肪酶（GELPs）基因。为了系统地鉴定GELPs，我们检索了之前在Arabidopsis中鉴定的104个GELP基因的蛋白质序列[5]，并使用Clustal Omega对这些序列进行比对，生成了HMM（隐马尔可夫模型）谱型（使用HMMER v3.3.2 [26]）。生成的谱型被用作在B. juncea全基因组数据库中进行基于HMM的搜索的查询。
U型三角区域内二倍体和四倍体亚基因组中的GELP基因高度保守
基于HMMER的搜索在Brassica的U型三角区域内鉴定出了215个、267个和257个独特的GELPs基因，分别存在于B. juncea、B. carinata和B. napus中。此外，在B. rapa（AA）中鉴定出132个GELP基因，在B. nigra（BB）中鉴定出122个基因，在B. oleracea中鉴定出133个基因（见补充表S1）。鉴定出的GELP蛋白长度介于249至456个氨基酸之间，预测分子量介于26.9至50 kDa之间。讨论
近年来，GDSL型酯酶/脂肪酶（GELPs）因其在中植物形态发生、发育调控、对生物和非生物胁迫的响应以及关键品质性状中的作用而成为备受关注的基因家族。在U型三角区域的物种中，此前仅在中B. napus和B. rapa中对其进行了研究[14]。本研究重新鉴定了这些物种中的GELP基因家族，以便对所有U型三角区域的物种进行全面分析。
结论
总之，我们鉴定了B. juncea及其相关物种中的GELP基因家族。串联重复事件显著促进了Brassicaceae植物中GELP基因家族的扩张。B. juncea中GELP基因的转录组分析表明它们在幼苗和种子发育中起重要作用。BjuSFAR基因的表达谱分析和单倍型分析揭示了它们在种子油脂积累中的作用。鉴定出的单倍型为进一步研究提供了重要线索。
作者贡献声明
Lakshay Goyal：撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、可视化、数据验证、调查、数据分析、概念化。Shubhashree Pradhan：撰写、审稿与编辑、可视化、数据验证、调查、数据分析。Shivani Gajbhiye：撰写、审稿与编辑、可视化、数据验证、调查、数据分析。Aryan Vashisht：撰写、审稿与编辑、数据验证。Riya Verma：撰写——资助
本研究得到了印度生物技术部（DBT）的支持，项目名称为“DBT-UDSC Partnership Centre on Genetic Manipulation of Brassicas - 第二阶段”（项目编号：BT/PR44569/AGIII/103/1334/2021）。
未引用的参考文献
[40]
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
我们衷心感谢Anchal Chaudhary女士（印度旁遮普邦BRIC-National Agri-Food and Biomanufacturing Institute的技术官员）在NIRS系统校准和运行方面的协助。同时感谢BRIC-NABI的中央仪器设施提供的基础设施和仪器支持，以及国家超级计算任务（NSM）为NABI提供的PARAM Smriti计算资源，该资源由C-DAC负责实施。
