《ACS Sensors》：Synthetic DNA Transducers Integrate DNA Repair to CRISPR Signal Transduction
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本文报道了一种创新的合成DNA传感器平台，通过将碱基切除修复（BER）酶活性与CRISPR-Cas12a信号放大系统直接偶联，实现了对DNA糖基化酶（如UDG、hOGG1）活性的高灵敏度、单步检测。该平台利用DNA发夹结构的设计，仅在酶修复后激活Cas12a的反式切割活性，为DNA修复活性监测及抑制剂高通量筛选提供了通用框架。
合成DNA传感器整合DNA修复与CRISPR信号转导
引言
CRISPR分子诊断技术已彻底改变核酸检测领域，然而将上游酶活性整合至可编程CRISPR输出仍鲜有探索。本研究提出一种合成转导平台，直接将内源性DNA修复活性与CRISPR-Cas12a激活相耦合。通过将碱基切除修复（BER）事件与可编程DNA传感器的结构转换相链接，成功将DNA糖基化酶（如尿嘧啶DNA糖基化酶UDG和人类8-氧鸟嘌呤糖基化酶hOGG1）的活性转化为通过Cas12a介导的旁侧切割产生的荧光信号。这一单步检测法能够快速、灵敏且高特异性地基于裂解液检测修复活性，并可轻松适配用于小分子抑制剂的高通量筛选。其模块化设计支持适配多种糖基化酶活性，为将DNA修复活性转导为可编程CRISPR输出建立了通用框架。
结果与讨论
合成DNA传感器实现DNA修复激活的CRISPR信号转导
研究团队合理设计了一组合成DNA分子传感器，该传感器可被编程为仅在特定修复活性发生后激活CRISPR-Cas12a系统。该DNA传感器具备三个关键特征：首先，它是一种合成DNA发夹结构，其序列中含有一个或多个受损核苷酸；其次，它能被特定的DNA修复酶识别为其天然酶底物；第三，其设计使其能够呈现两种不同的构象状态，即在修复活性发生前，它处于Cas12a非活性的发夹结构，仅在修复活性发生后才转换为Cas12a活性的构象。该设计利用了修复活性引起的发夹结构不稳定性，从而有效调控Cas12a核糖核蛋白（RNP）的结合与活性。
UDG响应型DNA传感器的设计与Cas12a活性调控
作为概念验证，研究团队设计了针对尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）敏感的DNA传感器，用于下游调控CRISPR-Cas12a系统。UDG能特异性识别并切除DNA中的尿嘧啶碱基，通过水解N-糖苷键生成脱碱基（AP）位点，从而启动BER通路。研究人员设计了一系列UDG传感器，在其非靶链（NTS）的发夹茎部区域嵌入了不同数量的尿嘧啶损伤。实验结果表明，含有尿嘧啶损伤的UDG传感器可作为Cas12a的调控开关，在UDG添加后产生时间依赖性的荧光增强。尿嘧啶数量从1个增加到4个时，Cas12a信号转导的初始反应速率显著加快，这表明多个AP位点的产生加剧了发夹结构的不稳定性，从而促进了Cas12a RNP的结合与激活。使用不同Cas12a同源蛋白（如LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a）的实验均证实了该平台的普适性。变性PAGE分析进一步证实，Cas12a的顺式切割活性仅发生在含有尿嘧啶残基且经过UDG处理的DNA传感器中。热变性实验和凝胶迁移实验均支持了修复诱导结构重排的机制。
基于Cas12a的实时监测人细胞裂解液中的UDG活性
研究团队在野生型HEK293T细胞裂解液中测试了基于Cas12a的UDG活性检测方法。该检测法能够在0.0085至0.65 U/mL的动态范围内检测UDG活性，检测限（LOD）低至0.0009 U/mL。加标回收实验证实了该方法在复杂生物样品中检测UDG活性的准确性。此外，在过表达尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）的HEK293T裂解液中，该方法实现了对UNG活性的高灵敏度实时监测。通过添加尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂（UGI），观察到荧光强度的剂量依赖性降低，证明了该检测法能够实时监测糖基化酶活性并直接筛选抑制剂。
合成DNA传感器将hOGG1活性重连至Cas12a信号放大
为了证明该策略的通用性，研究团队进一步测试了针对人类8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶1（hOGG1）的传感器。hOGG1是一种双功能糖基化酶，不仅能切除受损碱基，还能在生成的AP位点处切割磷酸二酯键。研究人员设计了一种hOGG1响应型DNA传感器，在其crRNA靶向序列中部插入单个8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）损伤。当hOGG1切除8-oxoG后，其相关的裂解酶活性会导致链的切割，释放一个短DNA片段，从而破坏发夹结构，暴露靶链上的未配对核苷酸，最终使得Cas12a RNP能够结合并激活，切割荧光报告分子。该平台对hOGG1的检测限达到14.2 ng/mL，并显示出高特异性。在HEK293T细胞裂解液中的加标回收实验显示回收率在101%至115%之间，验证了该单步检测方法的准确性。
基于Cas12a的hOGG1抑制剂高通量筛选
利用该单步CRISPR检测法的高灵敏度和快速响应特性，研究团队将其应用于hOGG1小分子抑制剂的高通量筛选。测试了多种已知的hOGG1和Fpg抑制剂，包括O8（Inh #1，抑制AP裂解酶活性）和SU0268（Inh #2，抑制DNA结合和碱基切除活性），以及2-硫代黄嘌呤（2TX）的衍生物（Inh #3, #4, #5）。实验获得了相应的半数抑制浓度（IC50）值，并通过热图清晰展示了不同抑制剂对细菌和人类酶的选择性抑制效果。该单步筛选在96孔板中进行，每次测试成本低廉，且Z‘因子为0.82，证明了其适用于高通量自动筛选的鲁棒性，为DNA修复靶向治疗提供了应用潜力。
结论
本研究开发的合成DNA传感器能够在酶修复后激活CRISPR-Cas12a，实现了对DNA糖基化酶活性的快速、实时监测。该平台利用修复酶对损伤DNA碱基的底物特异性，将损伤识别转化为放大的荧光输出，解决了传统活性检测方法依赖化学修饰探针、灵敏度低、步骤繁琐等局限性。与已报道的CRISPR策略相比，该系统无需辅助酶、复杂的探针结构或顺序添加试剂，信号放大仅通过简单混合溶液中的组分即可实现。其基于DNA发夹底物的设计模拟了DNA修复酶的自然靶标，简单的设计使其能够轻松适配不同的DNA损伤，支持在DNA修复通路中的广泛应用。除了生物分析应用，该平台为DNA修复抑制剂的通量筛选提供了强大框架，并有助于整合到响应细胞状态的合成基因电路以及实时监测DNA修复和药物筛选中。
