《Applied Soil Ecology》：Ecotoxicological responses to 6PPD-Q: Oxidative stress, gene expression dysregulation, and transcriptomic alterations in
Eisenia fetida
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本研究以赤子爱胜蚯蚓为模型生物，通过28天不同浓度（10、100、1000 μg/kg）的6PPD-Q暴露实验，系统评估其生态毒性及分子机制，发现高浓度组显著抑制蚯蚓生长与繁殖（>60%），引发氧化应激及肠道损伤，转录组分析揭示405个差异基因涉及xenobiotic代谢、DNA保护等通路，为土壤生态系统风险提供依据。
王小毅|王倩|吕慧娟|姚向峰|李宪旭|史若萌|丁佳|Ravil Baibekov|Lubsan-zondy Budazhapov|王俊
山东农业大学资源与环境学院，农业环境重点实验室，泰安，271018，中国
摘要
N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺醌（6PPD-Q）是轮胎抗氧化剂N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺（6PPD）的高毒性环境转化产物，通过轮胎磨损颗粒在土壤中持续积累，对土壤生态系统构成潜在威胁。因此，在本研究中，选择Eisenia fetida作为测试生物，进行为期28天的6PPD-Q暴露实验。设置了三种6PPD-Q暴露浓度（10、100和1000 μg/kg）。结合生物、生理、生化和分子以及转录组学方法，系统研究了6PPD-Q在土壤中的生态毒性及其作用机制。结果表明，6PPD-Q暴露抑制了蚯蚓的生长、发育和繁殖能力。具体而言，高浓度组中幼蚯蚓的生长抑制率和减少率超过60%。同时，相关功能基因的表达水平下调。6PPD-Q暴露导致活性氧（ROS）过度积累，从而引发抗氧化酶活性的系列变化。相关功能基因检测和分子对接（6PPD-Q与SOD和TCTP）的结果进一步验证了上述表型变化和氧化应激反应。此外，氧化应激还导致蚯蚓肠道组织损伤和病理变化。转录组分析鉴定出405个差异表达基因，揭示了与外源物质代谢、解毒防御、脂质稳态和DNA保护相关的通路显著紊乱。总体而言，本研究提供了多层次数据和科学证据，支持对土壤生态系统中6PPD-Q的生态风险评估和环境调控。
引言
轮胎磨损颗粒（TWPs）是全球微塑料污染的主要来源，其年排放量超过600万吨（Wang等，2024a）。TWPs含有N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺（6PPD），这是一种广泛应用于橡胶工业的抗氧化剂，因为它可以延长轮胎寿命并防止开裂（Zhang等，2023）。统计数据显示，某些欧洲国家的6PPD年产量在1000至15,000吨之间，而中国的年产量高达200,000吨（Chang等，2024）。此外，6PPD通过轮胎机械磨损释放到环境中，并与大气中的臭氧反应形成更具毒性的醌衍生物N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺醌（6PPD-Q）（Zhao等，2023）。迄今为止，6PPD-Q已在包括水、土壤和空气在内的多种环境介质中被检测到（Zhang等，2022a；Xu等，2023a；Yan等，2024）。在中国代表性城市（如郑州、太原和香港），PM??中6PPD-Q的总检测率高达81%，中位浓度范围为1.7至6.7 pg/m3（Cao等，2022）。因此，大气中的6PPD-Q可以通过降雨和降雪等干湿沉降过程进入水生环境（Sieber等，2020）。相关监测数据显示，中国河流中的6PPD-Q浓度范围为0.26至11.3 ng/L，而加拿大河流和融雪水中的相应值分别为290–890 ng/L和600 ng/L（平均值）。值得注意的是，美国河流中的6PPD-Q浓度甚至更高，范围为200–3500 ng/L。此外，香港城市径流中的6PPD-Q浓度为210至2430 ng/L，加拿大雨水中的浓度为80至1400 ng/L（Chen等，2023）。6PPD-Q在土壤和道路环境中的污染特征更为明显，路边土壤的检测率为100%。具体来说，香港路边土壤中的6PPD-Q浓度范围为9.50–936 μg/kg（Cao等，2022）。在中国，广州道路灰尘和宁波（浙江省）道路旁绿化带土壤中的6PPD-Q总浓度分别为3.0509 μg/kg和0.85–12.58 μg/kg（Wu等，2024）。同时，日本东京收集的道路灰尘中的6PPD-Q浓度范围为116至1238 μg/kg（Zhang等，2024）。6PPD-Q在土壤中的广泛和异质分布直接扰乱了土壤生物的生理代谢和群落结构，导致氧化损伤、代谢失衡和群落多样性变化。此外，它还影响土壤的物理化学性质（如酶活性和pH值）和生态功能，从而破坏土壤健康的稳态（Wu等，2024；Zhou等，2025）。
6PPD-Q对水生生物具有极强的毒性；在表层水中以ng/L水平暴露会导致帝王鲑（Oncorhynchus kisutch）急性死亡（Tian等，2021）。它还会干扰斑马鱼幼体的神经发育并引起心脏毒性，并对中国稀有鲦鱼（Obiocypris rarus）具有急性致死性；96小时LC??值为162–201 ng/L（Di等，2022；Varshney等，2022）。除了水生毒性外，6PPD-Q还影响陆地生物。小鼠高剂量暴露会引发肝脏毒性、肺部损伤和免疫调节效应（Fang等，2023；Qiu等，2025）。在线虫中，6PPD-Q影响多种生理过程，包括运动行为、感觉感知、神经发育、脂质积累和生殖健康（Wang等，2023；Liu等，2024a；Liu等，2024b）。6PPD-Q暴露还与人类健康风险相关，特别是对生殖系统、免疫功能和肝脏完整性的损害（Qin等，2025；Yu等，2025）。尽管6PPD-Q的水生毒性已有充分记录，但关于土壤生物的研究仍有限。当前研究证实了6PPD-Q对蚯蚓能量代谢、脂质稳态和肠道微生物组结构的破坏（Shi等，2025a；Zhou等，2025）；然而，其对土壤生物的分子水平影响尚未完全阐明。因此，迫切需要系统研究6PPD-Q对土壤生物的剂量依赖性毒性效应。
土壤动物是土壤生态系统的核心组成部分，在养分循环、污染物降解和能量传递中发挥关键作用（George等，2019）。蚯蚓作为“生态系统工程师”，在有机物分解和土壤结构改善中起着重要作用（Singh等，2016）。由于对污染物的敏感性，蚯蚓被用作土壤毒性评估的模型生物（Zhang等，2022b）。其中，Eisenia fetida因其全球分布、易于培养和较短的繁殖周期而在土壤毒理学研究中得到广泛应用（Qian等，2023）。
基于这一基础，本研究使用E. fetida作为模型生物，系统研究了6PPD-Q暴露在多个生物学水平上的毒性效应和作用机制：个体（生长和繁殖）、生理-生化（酶活性）和分子（基因表达、分子对接和转录组）层面。本研究的目标是（1）量化土壤环境中6PPD-Q浓度与蚯蚓反应指标之间的剂量-反应关系；（2）阐明6PPD-Q在蚯蚓中诱导毒性的机制途径。研究结果提供了多层次数据，支持对土壤生态系统中6PPD-Q的生态风险评估，并为新兴污染物的环境调控提供科学依据。
材料与试剂
6PPD-Q（纯度≥97%，CAS 2754428–18-5）购自Macklin Biochemical Co., Ltd.（中国上海）。所有其他化学试剂均从Kaitong Chemical Reagents Co., Ltd.（中国天津）购买，均为分析级。
蚯蚓培养与适应
E. fetida来自中国江苏的一个专业蚯蚓繁殖中心。用于蚯蚓培养的土壤遵循经济合作与发展组织（OECD）的指南，由70%石英砂、20%高岭土和10%
6PPD-Q暴露对蚯蚓生长、发育和繁殖的影响
作为轮胎抗氧化剂6PPD的主要环境转化产物，6PPD-Q对多种生物的生长、发育和繁殖功能具有显著毒性作用（Jiao等，2025）。基于这一背景，本研究系统评估了6PPD-Q对E. fetida的生长和繁殖的影响，E. fetida是土壤生态系统中的关键生态指示物种，以阐明其在陆地无脊椎动物中的生态毒性特征。
结论
本研究系统研究了6PPD-Q的生态毒性及其潜在的毒理学机制，结合转录组分析提供了机制见解。6PPD-Q暴露抑制了E. fetida的生长、发育和繁殖。此外，蚯蚓中ROS的过度积累引发了氧化应激反应，进一步导致脂质过氧化、氧化DNA损伤和肠道组织损伤。
CRediT作者贡献声明
王小毅：撰写——原始草案、调查、正式分析、概念化。王倩：撰写——审阅与编辑、正式分析。吕慧娟：方法学、调查。姚向峰：方法学、调查。李宪旭：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取。史若萌：方法学、调查。丁佳：方法学、调查。Ravil Baibekov：撰写——审阅与编辑、监督、资源。Lubsan-zondy Budazhapov：撰写——
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划 [项目编号 2024YFD1701103]、国家自然科学基金 [项目编号 42507053、U2106212 和 42177024]以及太原市双十计划 [项目编号 2024JSGG10]的支持。
