揭示农业土壤中碳固定与氮固定耦合的微生物机制

《Applied Soil Ecology》：Unraveling the microbiological mechanism of carbon and nitrogen fixation coupling in agricultural soils

长期施肥对土壤碳氮固定耦合及微生物驱动机制的影响研究。通过13CO2和15N2同位素探针技术，分析了6个长期施肥试验点（CK、NPK、NPKOM）的碳氮固定耦合关系及微生物驱动机制。结果表明：NPK施肥显著削弱碳氮耦合（R2=0.10），而NPKOM部分恢复（R2=0.17）；关键微生物门（Chloroflexi、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria）丰度与土壤C:S、C:N比率显著相关（

　　

云芳|范浩欣|孟向天|王娟|葛朝荣|姚怀英

中国武汉工业大学环境生态与生物工程学院，教育部绿色化学工艺重点实验室，长江中游生物元素微生物转化与调控湖北省重点实验室，武汉，430205

摘要

了解土壤微生物碳固定与氮固定之间的耦合关系对于评估陆地碳汇的功能至关重要，但在长期施肥的农业生态系统中这一关系仍不明确。本研究利用¹³CO₂和¹⁵N₂基于DNA的稳定同位素探针技术，研究了六个长期施肥条件下（无肥料（CK）、矿物NPK以及添加有机改良剂的NPKOM）的农业生态位点的碳固定和氮固定速率及其相互关系，并探讨了背后的微生物驱动因素。长期施肥导致碳固定出现了两种不同的响应模式，而氮固定总体保持稳定，但存在地点特异性差异。在未施肥条件下，CO?和N?的固定之间存在强烈的耦合关系（斜率=0.290，R²=0.786，P<0.001）。NPK施肥打破了这种关系（斜率=0.107，R²=0.100；ANOVA，P<0.05）。添加有机改良剂后，这种耦合关系部分得到恢复（R²=0.171，P=0.089），但回归斜率仍然较低。同时，施肥改变了吸收CO₂和N₂的微生物群落，其中Chloroflexi、Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria成为关键类群，它们采用了从双重吸收到次级代谢物利用的策略。这些群落变化受到土壤化学计量的强烈影响，尤其是C:S和C:N比例，这些比例共同解释了活跃的碳固定和氮固定群体结构变化的30%以上。总体而言，我们的研究表明，长期施肥通过改变过程速率、重组微生物群落以及削弱土壤碳固定与氮固定之间的耦合关系，破坏了生物地球化学的韧性，突显了土壤化学计量和响应性微生物类群的主导作用。

引言

土壤在全球碳（C）和氮（N）循环中起着关键作用。全球范围内，土壤是陆地生态系统中最大的碳库，储存了高达2200 PgC的有机碳——大约是植被中碳含量的三倍，也是大气中碳含量的两倍（Batjes, 1996; Eswaran et al., 1993; Scharlemann et al., 2014）。土壤也是氮循环的核心组成部分，促进了诸如肥料中的氮输入用于作物生长、氮通过畜牧业系统的流动、大气N₂的生物固定以及N₂的反硝化回到大气中的过程（Sutton et al., 2011; Galloway et al., 2004）。这些大规模的生物地球化学过程主要由土壤微生物的代谢活动驱动（Kallenbach et al., 2016; Liang et al., 2017; Hu et al., 2022）。鉴于其重要性，理解土壤碳和氮固定的微生物机制已成为气候变化和全球变暖背景下的一个重要研究焦点。

土壤中碳循环和氮循环的耦合关系已在包括森林、草原和农业系统在内的各种陆地生态系统中得到了广泛研究。在森林生态系统中，氮输入根据森林的氮状况影响碳和氮循环。适度的氮沉积可以促进生物生长并增加土壤碳排放（Zheng et al., 2022; Zheng and Mo, 2022），而过量的氮沉积则会抑制生物生长并减少土壤碳排放（Zheng et al., 2022; Zheng and Mo, 2022）。人工森林中的土壤碳和氮随着土壤深度的增加而分离，而在天然森林中，所有土壤深度的土壤碳和氮都高度耦合（Gong et al., 2025）。在草原生态系统中，自然过程如启动效应、硝酸盐淋溶和生物C和N固定通过平衡过量元素的释放和调节有机质固定来维持碳和氮循环的耦合。然而，家养食草动物通过释放可消化的碳（CO₂和CH₄）以及通过尿液斑块以浓缩形式返回氮，破坏了这种平衡（Soussana and Lemaire, 2014）。草原管理措施，如优化氮和磷的施肥，可以通过刺激植被和微生物活动来增强C和N的耦合，而过高的放牧密度则会减少碳在系统中的停留时间。因此，草原集约化的环境影响取决于植被和微生物耦合与食草动物导致的解耦之间的权衡。

尽管在各种生态系统中都记录了碳循环和氮循环的耦合关系，但在农业系统中的表现和脆弱性具有独特的特点和挑战。与碳和氮通量主要由缓慢的生物过程控制的自然生态系统不同，农业系统的特点是人为干预的强度大。合成氮肥的大量输入从根本上改变了化学计量平衡，并加速了氮的周转，往往超过了系统固有的碳同化和稳定能力（Tong et al., 2009; Hao et al., 2008）。这种不平衡进一步受到耕作等做法的加剧，耕作破坏了土壤结构并促进了土壤有机质的矿化，导致碳和氮的连续损失。因此，长期施肥如何影响土壤C和N循环之间的耦合关系的机制基础仍然是一个关键且理解不足的知识空白。

现在人们认识到土壤微生物是C和N动态的核心驱动因素（Kallenbach et al., 2016; Liang et al., 2017; Hu et al., 2022）。自养CO₂固定每年贡献70 PgC，而生物氮固定为陆地生态系统提供40–100 Tg N，支持初级有机物的生产（Berg, 2011; Vitousek et al., 2013）。碳和氮流的耦合最终由土壤微生物组中的特定功能群落介导。可能参与这种协调的关键微生物包括：（i）自养生物（例如，光自养生物和化能自养生物），它们利用光能或无机化合物的氧化将CO?固定为有机碳；（ii）固氮生物，它们将大气N₂还原为氨；（iii）硝化细菌和反硝化细菌，它们协调各种氮物种的转化，并通常与碳代谢相关；以及（iv）有机物分解者，它们分解复杂的有机化合物，释放碳和氮，从而影响其他微生物的底物可用性。理解调节微生物C和N耦合的过程对于推进全球生物地球化学循环的知识至关重要。然而，这些微生物过程在长期施肥下的相互作用以及控制其耦合的因素仍然是一个未解之谜。

为了解决这一空白，我们的研究旨在直接探讨耦合机制，而不仅仅是观察各个过程的速率。我们采用了一种综合方法，结合了地球化学测量和微生物生态技术。关键的是，我们使用了¹³CO?和¹⁵N₂标记的DNA稳定同位素探针技术（DNA-SIP）。这项强大的技术使我们能够识别在同一土壤样本中积极参与CO?和N₂吸收的微生物类群，从而提供了负责C-N耦合的微生物群体的直接、原位证据（Liu et al., 2024）。

本研究旨在通过结合DNA-SIP方法和统计分析，探讨长期施肥如何影响农业系统中碳和氮的耦合关系。具体目标是：（i）识别负责连接碳和氮固定的活跃土壤类群；（ii）评估长期施肥对土壤微生物C和N固定耦合的影响；（iii）确定驱动碳和氮固定耦合的关键因素。通过实现这些目标，本研究旨在深入理解控制土壤C和N动态的机制及其对可持续农业实践的影响。

部分内容摘要

土壤采样和性质分析

从中国六个长期施肥实验地点（成都（CD）、阜康（FK）、衢州（QZ）、绍兴（SX）、沈阳（SY）和武汉（WH）收集了表土（0–20厘米）样本（表S1；图S1）。选择这些地点是为了涵盖关键背景因素的变化：气候（平均温度：6.6–18.0°C；年降水量：186–1461毫米）、作物系统（包括稻麦轮作和小麦-玉米轮作）以及土壤固有性质（例如，质地从壤土到粉壤土；初始pH值从5.65到9.21）（Meng et

长期施肥对碳和氮固定速率耦合的不同影响

六个长期施肥地点的碳固定速率发生了显著变化（图1a）。出现了两种响应模式：（模式a：下降-恢复）在NPK施肥下碳固定速率下降，然后在NPKOM下恢复甚至增强（成都、沈阳和武汉）；（模式b：持续增加）在NPK和NPKOM下碳固定速率持续增加（阜康、衢州和绍兴）。碳固定响应的差异与土壤pH值的变化密切相关（表S2）。在模式a的地点（成都、

长期施肥破坏了CO₂和N₂固定速率之间的正相关关系

在未施肥条件下，CO₂和N₂的固定速率显著且正相关（图1b），表明这两种过程在农业生态系统中可能存在耦合关系。在自然条件下，由于驱动碳、氮和磷循环的生物体中相对保守的元素化学计量，碳和氮循环在分子到全球尺度上是生物耦合的（Finzi et al., 2011）。这种耦合发生在特定的元素化学计量比下

结论

总之，本研究表明，长期施肥显著改变了农业生态系统中碳和氮固定之间的耦合关系。在六个实验地点，碳固定对施肥表现出两种不同的响应模式，而氮固定除了在某些地点外总体上保持稳定。NPK施肥一致地削弱了碳和氮固定之间的正相关关系，而添加有机改良剂则

CRediT作者贡献声明

云芳：撰写——初稿、方法论、研究、数据管理。范浩欣：撰写——初稿、软件、方法论、研究、数据管理。孟向天：方法论、研究、数据管理。王娟：方法论、研究、数据管理。葛朝荣：方法论、研究、数据管理。姚怀英：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金 [资助编号W2412148、U24A20626 和 42477135]的支持。