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香港大闸蟹高盐高温复合应激下存活率、能量代谢及基因表达机制研究。通过实验室模拟冬季高盐（32‰）与高温（30℃）环境，发现单独应激不显著降低存活率，但两者协同作用使存活率骤降至24%（对照组99%），并伴随能量代谢失衡（ATP/ADP比值下降）及免疫相关基因（如HSP70、 Heat shock protein 90）表达上调。长期暴露导致糖原储备耗竭，细菌群落α多样性下降42%，其中Vibrio aestuarianus丰度增加3倍。研究揭示多因子应激诱导的代谢重编程是大规模死亡的关键机制，为建立环境-病原交互作用预警模型提供依据。
李天航|邓欣|何远秋|姚尚平|郑英秋|Abu Kawsar博士|肖舒|张阳|Vengatesen Thiyagarajan
香港大学海洋科学研究所与生物科学学院，中国香港特别行政区
摘要
牡蛎对水产养殖和生态系统都具有重要意义。然而，在重要的牡蛎养殖物种中，大规模死亡事件屡见不鲜，这种情况由于环境变化而日益严重。现有的关于牡蛎死亡的研究主要集中在野外观察或单一致病因素的验证上。然而，尚不清楚由多种生物和非生物压力因素相互作用引发的牡蛎死亡的表型和分子机制。本研究通过实验室实验模拟了冬季实际自然条件下的高盐度和高温环境，探讨了牡蛎在单独和同时受到这两种环境压力下的存活情况、与能量相关的代谢物含量、基因表达以及细菌群落的变化。此外，还向这些受压的牡蛎中注射了Vibrio aestuarianus菌。生存数据表明，高盐度和高温之间存在显著的协同效应，这一结果得到了基因表达谱和能量代谢物含量的支持。长期暴露于环境压力下会改变基因表达模式并破坏能量代谢平衡。Vibrio感染与单一环境压力结合并不会立即导致牡蛎大规模死亡，但会改变血淋巴相关细菌的群落结构。研究表明，单一环境压力不太可能导致牡蛎死亡，而两种压力因素的结合则会导致大规模死亡。尽管需要进一步研究以确定冬季死亡的全部原因，但本研究对全球变化背景下的可持续水产养殖管理具有重要的启示意义。
引言
随着世界人口的增长，对海产品的需求也在同步增加，因为海产品是一种对粮食安全和营养至关重要的可持续食物来源。1961年，水生动物食品的消费量为9.1公斤，到2022年增加到20.7公斤（FAO，2024年）。2022年，全球渔业和水产养殖产量达到了1.85亿吨的新纪录，其中水产养殖产业占全球水生动物产量的51%（FAO，2024年），而三十年前这一比例为20%（FAO，2024年）。在这一不断扩大的生产领域中，软体动物占总水产养殖产量的20%（FAO，2024年）。大多数软体动物（如牡蛎、贻贝、扇贝等）在生长阶段不需要人工喂养，因此成本效益高且是高质量的人类蛋白质来源。
在具有商业价值的软体动物中，牡蛎在水产养殖和生态功能中扮演着重要角色。牡蛎礁拥有丰富的生物多样性，能够过滤水中的污染物。2022年，杯状牡蛎（Crassostrea属）占软体动物水产养殖产量的37.4%，成为全球第二大养殖水生动物，产量为620万吨（FAO，2024年），这凸显了牡蛎养殖的全球重要性，它不仅增强了粮食安全，还为许多国家提供了就业机会。然而，在大多数重要的牡蛎养殖物种中（Crassostrea gigas, Crassostrea virginica, Crassostrea hongkongensis 和 Saccostrea glomerata），经常发生大规模死亡事件。这些死亡事件通常以发生死亡事件的季节或受影响的物种命名，例如“夏季死亡”（George等人，2023年；Malham等人，2009年）或“太平洋牡蛎死亡综合征”（Gawra等人，2023年）。虽然这些死亡事件可以归因于多种原因，但只有少数原因得到了全面研究并有证据支持。例如，在全球养殖最广泛的C. gigas牡蛎中，大规模死亡事件在法国、美国、加拿大、中国、日本、韩国等地都有记录（Advani和Satterfield，2024年；Barbosa Solomieu等人，2015年；Heo等人，2023年；Li等人，2022年）。这些死亡事件与病原体（如牡蛎疱疹病毒（OsHV-1）和Vibrio aestuarianus）以及环境影响（高温和低盐度）有关（Advani和Satterfield，2024年；Petton等人，2015年）。在C. virginica中，大规模死亡归因于病原体MSX（Haplosporidium nelsoni）和Dermo（Perkinsus marinus）或环境压力（低盐度和高温）（McCarty等人，2020年）。
香港牡蛎C. hongkongensis（Lam和Morton，2003年）（现被归类为Magallana hongkongensis）是一种高价值的水产养殖物种，2019年的产量为180万吨，占全球牡蛎产量的四分之一以上（Qin等人，2021年）。这种物种的养殖遍布中国整个南部海岸。仅在2021年，香港就收获了123吨牡蛎肉，价值1500万港元（约190万美元）（Lee等人，2024年）。尽管香港牡蛎的产量非常大，但当地社区每年都会观察到大规模死亡事件，然而只有少数研究记录了不同地区的这种情况。首次科学记录和研究的死亡事件发生在2022年的香港深湾（Lee等人，2024年）。虽然这项研究没有确定香港死亡事件的确切原因，但它成功地记录了死亡模式，排除了寄生原生动物作为潜在原因，并强调了冬季盐度和温度升高作为环境压力因素对死亡的影响（Lee等人，2024年）。
在回顾了香港牡蛎及其他牡蛎物种的大规模死亡相关文献后，我们假设多种环境压力因素（即盐度和温度）可能在这些事件中起叠加或协同作用。这些环境压力因素可能会削弱牡蛎的生理和免疫能力，使它们更容易受到细菌感染。然而，这一假设主要基于野外观察数据，缺乏足够的实验室规模证据来验证环境压力因素与死亡事件期间细菌感染之间的相互作用。因此，本研究旨在探讨长期暴露于高盐度和高温（单独或共同作用）对香港牡蛎的影响，并从能量和转录组的角度阐明牡蛎对这些压力的反应机制。使用与能量相关的代谢物作为指标来评估牡蛎的状态，并了解它们与压力适应机制之间的关系。除了环境压力因素外，还从深湾濒死的香港牡蛎中分离出一种已知会导致牡蛎疾病的细菌（Vibrio aestuarianus），并将其注入牡蛎中，以测试细菌感染对虚弱牡蛎及其血淋巴中相关细菌群落的影响。本研究旨在解决与香港牡蛎冬季大规模死亡相关的几个关键问题：1）单独的环境压力因素（高盐度或高温）是否会导致香港牡蛎的大规模死亡？2）环境压力因素的结合是否会对牡蛎死亡产生协同效应？3）已知的牡蛎致病细菌是否会在因环境压力而虚弱的牡蛎中引发大规模死亡？4）哪些与能量相关的代谢物可以作为环境压力下牡蛎状态的指标，或用于早期检测大规模死亡事件？5）在实验室模拟的牡蛎死亡和Vibrio感染过程中，基因表达谱和相关微生物组如何变化？通过强调多种生物和非生物压力因素在牡蛎死亡中的作用，这项研究对海洋生物学和水产养殖领域具有深远的影响，特别是关于香港牡蛎的可持续性和恢复力。本研究的结果可能为制定有效策略以减轻死亡事件提供指导，从而在全球气候变化的背景下保护牡蛎种群及其支持的产业。
实验设置
实验中使用的香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis，也称为Magallana hongkongensis）来自香港唯一的牡蛎养殖区深湾（图1）。这些牡蛎是孵化场生产的种子，原产于中国泰山。牡蛎的年龄为1.5岁，平均高度为87.5毫米，范围在55至124毫米之间（基于307只实验动物中的64只进行估算）。牡蛎被清洗并去除了生物污垢。
高温度和高盐度条件下的存活率
暴露于高温度和高盐度（HSHT）条件下的牡蛎存活率迅速且持续下降，导致该处理在16天后提前终止，而最初预计的处理时间为两个月（图3A）。16天时，HSHT处理组的平均存活率为24%，显著低于对照组（图3B，LSLT：99%±3%，广义线性模型（glm），p = 0.001）。
环境压力对存活率的影响
环境压力被广泛认为是全球牡蛎养殖业中大规模死亡事件的主要驱动因素（Advani和Satterfield，2024年；Lee等人，2024年）。在中国南部当前发生的大规模死亡背景下，本研究特别探讨了复合环境压力因素（即高温度和高盐度）对牡蛎存活率的影响。
CRediT作者贡献声明
李天航：撰写——原始草稿、方法学、调查、概念化。邓欣：撰写——原始草稿、可视化、软件、概念化。何远秋：撰写——审稿与编辑、可视化、软件。姚尚平：可视化、验证。郑英秋：撰写——审稿与编辑、可视化。Abu Kawsar博士：撰写——审稿与编辑。肖舒：撰写——审稿与编辑、验证。张阳：验证、监督、方法学、资金获取。
致谢
作者感谢Chan Kwok Leung先生在实验用牡蛎获取和海水运输方面的帮助，这对本研究的实施至关重要。研究助理Gradicherla Hari Krishna在藻类培养和实验数据收集方面提供了关键支持。高级实验室技术员Jessie Lai在后勤和技术支持方面给予了巨大帮助。本研究得到了战略优先项目的支持。
