凋亡和FoxO信号通路构成了泥蟹（Scylla paramamosain）对抗MCRV病毒的核心抗病毒防御机制

《Aquaculture》：Apoptosis and FoxO signaling axis form the core antiviral defense in mud crab ( Scylla paramamosain) against MCRV

泥蟹感染MCRV病毒后通过凋亡相关通路和SpFoxO介导的RNAi通路抑制病毒复制，激活凋亡可降低病毒载量并提高存活率，而抑制凋亡会加速病毒传播。该研究为抗MCRV策略提供了分子机制依据。

　　

王晓宇|陈亮宇|彭静|罗梓轩|张明|孙倩|阮国团|赵贤良|张月玲|郭志勋|李胜康

中国广东省海洋生物学重点实验室，汕头大学，汕头515063

摘要

泥蟹（Scylla paramamosain）是东南亚重要的经济养殖甲壳类物种，其年产量持续增长，具有很高的经济价值。然而，近年来，泥蟹养殖业遭受了重大疾病爆发的影响，其中泥蟹呼肠孤病毒（MCRV）是导致该物种大规模死亡的主要病原体，对产业发展构成了严重威胁。本研究通过转录组分析研究了泥蟹血细胞在MCRV感染后的抗病毒反应机制。结果表明，MCRV感染显著增强了与凋亡相关的通路，相关基因（如、caspase-3、bax和bag-1）的表达上调。功能实验表明，促进凋亡可以有效降低病毒载量，而抑制凋亡则会加速病毒复制。此外，对免疫信号通路的筛选发现，AMPK-FoxO通路中的转录因子SpFoxO表达显著上调，SpFoxO调控RNAi通路中的关键基因（包括dicer-2、ago2和draper），从而增强抗病毒能力。沉默SpFoxO基因会导致泥蟹病毒载量增加和存活率下降。相比之下，经典免疫通路（如TLR-Dorsal、IMD-Relish和JAK-Stat）的反应较弱或减弱。本研究提供了证据，证明泥蟹主要依靠凋亡和FoxO介导的抗病毒反应来抵抗MCRV感染，为未来的抗病毒干预和养殖业疾病管理提供了理论基础。

引言

泥蟹（Scylla paramamosain）是中国沿海地区重要的经济养殖物种，2023年的产量超过15.7万吨。近年来，泥蟹养殖业面临疾病的严重威胁，尤其是泥蟹呼肠孤病毒（MCRV）（Liu et al., 2017; Sravani et al., 2022; Sravani et al., 2024）。MCRV感染会导致泥蟹出现“睡眠病”，死亡率高达70%，造成巨大的经济损失（John et al., 2024; Weng et al., 2007）。MCRV是一种双链RNA（dsRNA）病毒，基因组由12个片段组成（24,464 kb），与其他已知的呼肠孤病毒几乎没有同源性，表明它是一个独立的物种（Zhang et al., 2023; Deng et al., 2012）。MCRV在泥蟹的目标器官（如肝胰腺、鳃和肠道）的结缔组织细胞胞质中复制。受感染的泥蟹表现出嗜睡、食欲减退和灰褐色体色，严重病例表现为肝胰腺萎缩和鳃松弛（Liu et al., 2017; Weng et al., 2007）。

凋亡是一种程序性细胞死亡过程，对于宿主清除病毒感染细胞、限制病毒复制和传播至关重要。例如，白斑综合征病毒（WSSV）通过外泌体传递给邻近细胞，激活凋亡相关基因表达并诱导凋亡以抑制病毒传播（Gong et al., 2024）。此外，外泌体中的miR-137和miR-7847靶向凋亡诱导因子，调节线粒体凋亡通路并抑制病毒复制（Gong et al., 2020）。然而，病毒进化出了多种机制来主动调节宿主细胞凋亡以支持其生存和传播。一些病毒通过抑制或诱导宿主细胞凋亡来支持自身复制，例如人类巨细胞病毒的UL37x1蛋白可抑制宿主细胞凋亡并促进病毒复制（Ren et al., 2022）。另一种病毒——裂谷热病毒则下调抗凋亡蛋白MCL-1，激活焦亡并促进病毒传播（Guan et al., 2024）。这种宿主-病毒相互作用体现了生物进化的复杂性，并为病毒感染的病理生理机制提供了新的见解。

近年来，关于无脊椎动物免疫机制的研究进展揭示了几条关键的免疫信号通路，包括TLR-Dorsal、IMD-Relish、AMPK-FoxO和JAK-Stat，这些通路共同构成了无脊椎动物复杂的免疫防御网络。例如，在虾类中，研究表明Toll4通过激活Dorsal来抵抗WSSV感染，进而诱导抗菌肽（AMPs）的表达（Li et al., 2018）。IMD-Relish是另一条重要的免疫信号通路，主要负责抗病毒防御。Drosophila melanogaster中的烟碱型乙酰胆碱受体α6（Dα6）亚单位通过激活IMD-Relish通路增强对多种RNA病毒的抵抗力（Wang et al., 2024）。在虾类中，dsRNA病毒可通过Dicer-2/AMPK/FoxO轴诱导非特异性抗病毒转录反应。Dicer-2介导的dsRNA切割消耗ATP，导致AMPK激活和FoxO核转位，从而促进抗病毒基因的表达（Gao et al., 2024）。此外，JAK-Stat通路可以调节细胞因子表达和信号转导，参与无脊椎动物的免疫细胞激活和免疫反应调节（Gao et al., 2021）。

在本研究中，我们系统地阐明了泥蟹对MCRV感染的分子反应机制。转录组分析显示，与凋亡相关的通路显著富集，表明凋亡通过清除受感染细胞来限制MCRV的复制和传播。进一步研究抗病毒通路发现FoxO信号通路对抵抗MCRV至关重要。我们的结果为开发有效的抗MCRV策略提供了新的见解和理论基础。

实验部分

泥蟹与MCRV挑战实验

从中国广东省汕头市的养殖区购买了约50克的泥蟹。这些动物在实验室中适应了一周，盐度为8‰，温度为25°C。通过PCR扩增确认泥蟹中不存在MCRV。本研究中使用的原始MCRV菌株由上海东海渔业研究所提供。在MCRV挑战实验中，每只泥蟹被注射了5×10⁵拷贝的MCRV菌株。

差异表达基因（DEGs）的鉴定与分析

通过与0小时对照组比较，在不同时间点鉴定出与MCRV感染相关的DEGs。分析结果显示：12小时时共有2690个DEGs（1272个上调，1418个下调）；24小时时共有2898个DEGs（1599个上调，1299个下调）；48小时时共有3612个DEGs（1969个上调，1643个下调）（图1A-C）。此外，这三个对照组之间共有1052个DEGs，这些基因被认为是进一步研究的候选对象。

讨论

MCRV是东南亚沿海地区泥蟹养殖业的主要病原体，导致严重的经济损失（Sravani et al., 2022; John et al., 2024）。了解细胞防御机制对于疾病管理至关重要；转录组研究已经揭示了鳃和肝胰腺对MCRV感染的反应机制。血细胞在病原体吞噬、抗菌肽合成、应激反应和免疫记忆中的作用

结论

本研究阐明了泥蟹血细胞对MCRV感染的转录组反应和抗病毒调控机制。转录组分析显示凋亡和FoxO信号通路发挥了重要作用。功能实验证实，激活凋亡通路能有效抑制病毒复制，而抑制凋亡则会增加病毒载量。值得注意的是，AMPK-FoxO通路是关键的抗病毒通路，SpFoxO的表达上调

CRediT作者贡献声明

王晓宇：撰写、审稿与编辑、研究设计。陈亮宇：资源获取、方法论。彭静：资源获取、方法论。罗梓轩：资源获取、方法论。张明：资源获取、方法论。阮国团：撰写、审稿与编辑。赵贤良：数据可视化、研究实施。张月玲：资源获取、方法论。郭志勋：资源获取、方法论。李胜康：撰写、审稿与编辑、监督、研究设计。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（42476099、32303052）、广西科技重大专项（AA23062047）、广西重点研发计划（AB24010115）、广东省自然科学基金（2024A1515011592）以及李嘉诚基金会联合研究基金（2024LKSFG04）的资助。