《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Dynamic metabolic model combined with key enzyme analysis reveals the high lipid synthesis mechanism of
Aurantiochytrium sp. mutant strain induced by ARTP
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本研究通过结合丙二酸胁迫筛选与ARTP诱变技术，成功分离出高DHA产量的A. sp. SW1突变株MA-4，其DHA含量达总脂的39.20%。通过代谢通量分析与关键酶活性研究，揭示了三羧酸循环酶及脂肪酸合成酶活性动态调控机制，建立了“诱变筛选-酶响应-通量调控”的系统研究范式，为微藻功能油脂生产提供了理论依据与技术支持。
Xu Wang|Xinhe Zhao|Zitong Zhao|Yue Liu|Feng Ji|Xuanwei Mei|Jianguo Chen|Xiaojie Ren
中国山东省工业大学农业工程与食品科学学院医学与食品同源性及中医健康研究所
摘要
为了解决Aurantiochytrium属发酵过程中的关键工业瓶颈问题，特别是细胞生长与脂质合成之间的协同作用不足，以及二十二碳六烯酸（DHA）转化率低的问题，本研究建立了一种结合“丙二酸胁迫筛选”与“ARTP诱变定向育种”的技术体系。通过将关键代谢酶分析与动态代谢建模相结合，构建了一个“诱变–酶响应–代谢通量调节”框架，系统阐明了高产DHA突变体的代谢调节机制。选择丙二酸作为筛选压力源，是因为它能够特异性抑制三羧酸（TCA）循环，从而将碳流重新导向脂质合成。结合常压和室温等离子体（ARTP）诱变（120 W，80 s，致死率为98.26%），并以相对荧光强度增加超过30%作为选择阈值，成功分离出了具有高生长速率和高脂质含量的MA-4突变株。与野生型菌株相比，MA-4突变株的细胞DHA含量增加了20.89%，DHA占总脂质的39.20%。酶活性分析显示，关键TCA循环酶异柠檬酸脱氢酶（IDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）在时间上发生了变化。这些酶在对数生长阶段和脂质积累阶段分别提供了能量支持，协调了细胞生长和脂质合成的能量需求。代谢通量调节分析表明，突变体中的脂肪酸合成酶（FAS）途径活性降低了45.45%，而聚酮合酶（PKS）途径活性增加了30.14%。这种变化使前体乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）特异性地流向不饱和脂肪酸的积累。此外，还发现了一种NADPH供应的时间调节机制，为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的合成提供了精确的还原力。动态代谢模型进一步验证了糖酵解（EMP）途径活性增加了20.21%。这加速了葡萄糖的分解，为下游代谢提供了充足的碳骨架，最终促进了DHA和其他多不饱和脂肪酸的有效碳流迁移。本研究不仅阐明了在ARTP诱变和丙二酸胁迫下Aurantiochytrium属高产DHA的核心代谢机制，还建立了一个系统的“诱变筛选–机制分析–通量优化”研究范式。这些发现为高产DHA工程菌株的合理设计以及克服工业微藻功能性油脂生产中的瓶颈提供了关键目标和技术支持。
引言
Omega-3脂肪酸是一类对人类健康至关重要的多不饱和脂肪酸。它们在神经发育、视觉功能和免疫调节等生理过程中发挥着关键作用[1]。近年来，由于海洋产油微生物具有独特的多不饱和脂肪酸（PUFAs）生物合成能力，因此受到了广泛关注。研究表明，如Thraustochytrium、Schizochytrium和Crypthecodinium等海洋异养微生物能够通过异养代谢高效积累DHA，其细胞内DHA含量可达到干重的30%-50%，显示出替代传统鱼油资源的巨大潜力[2; 3]。然而，野生型菌株通常面临代谢通量分布不平衡、辅因子再生效率低和油脂产量低等瓶颈。此外，非模式菌株的基因工程具有挑战性，这给定向育种和工业生产带来了经济可行性障碍。因此，高通量诱变与定向育种策略的结合是目前实现非模式微生物高效菌株开发的关键。除了诱变育种外，非生物胁迫诱导也是增强油料微生物脂质积累的关键策略。大量研究表明，外部条件（如氮/磷限制、盐度胁迫、渗透压波动、温度胁迫和氧化胁迫）可以触发代谢重编程。这一过程将碳流从生长相关合成转向能量化合物的储存，从而促进中性脂质和不饱和脂肪酸的积累，最终提高整体脂质含量[4; 5; 6]。在海洋油料微生物中，经常利用营养限制和温度胁迫来促进脂质积累。例如，Abrha等人报告称，氮限制显著促进了Scenedesmus sp. CABeR52的脂质积累，产量是氮充足条件下的两倍[7]。Sijil等人还发现，对Desmodesmus sp.进行独立低温胁迫处理后，脂质含量增加了34%，比对照组高1.5倍[8]。类似的胁迫诱导和过程控制策略也被应用于增强异养海洋油料微生物的脂质富集。总体而言，这些研究表明胁迫条件可以触发代谢通量的重新分配，从而放大突变体之间的脂质积累差异，促进更有效的定向筛选。因此，利用胁迫因子作为选择压力可以有效提高高产表型的识别概率。基于胁迫诱导脂质富集的原理，将胁迫策略与育种方法相结合，建立更高效的筛选系统，是提高非模式油料微生物性能的关键方向。
常压和室温等离子体（ARTP）诱变在微生物定向进化中显示出巨大潜力，因为它具有高突变率、操作安全性以及可控的遗传损伤。与传统诱变方法相比，ARTP通过活性物质诱导多种DNA损伤和修复，从而更容易获得稳定的表型突变体[9]。除了在增强脂质生产中的应用外，ARTP诱变已在多种高附加值产品的微生物育种中得到广泛应用，包括抗生素、功能性代谢物和工业酶。先前的研究表明，ARTP有助于生成多样化的突变体库。当与耐受性筛选、代谢胁迫选择和发酵过程优化结合使用时，该技术显著提高了目标产品的产量。例如，在放线菌育种中，ARTP已被用于分离出高产高价值抗生素的突变体。Zhao等人通过结合ARTP诱变和核糖体工程，成功获得了Saccharopolyspora pogona突变体，其丁烯基刺孢霉素产量显著提高[10]。在功能性代谢物方面，组合策略利用ARTP增强了类胡萝卜素等高价值化合物的生物合成能力。Ma等人通过结合ARTP和乙醇处理，使Haematococcus lacustris中的虾青素含量增加了47.6%[11]。这些发现证明了ARTP作为定向进化工具的多功能性和有效性，为当前研究中采用ARTP诱变与定向筛选提供了坚实的理论基础。此外，引入化学胁迫因子（如特定的代谢途径抑制剂）可以人工重新定向碳流分布。这种策略实现了细胞活力与定向代谢通量之间的耦合机制，从而显著提高了目标表型的筛选效率。研究表明，添加途径特异性代谢抑制剂可以有效调节细胞内碳流分布。例如，Zeng等人使用碘乙酸（一种糖酵解抑制剂）和脱氢表雄酮（一种戊糖磷酸途径抑制剂）与ARTP结合，使Chlorella中的DHA产量增加了58.5%[12]；Liu等人通过干预乙酰辅酶A羧化酶抑制剂，进一步提高了Crypthecodinium突变体的脂质积累量7.05%[13]。这些发现为构建多压力协同筛选系统提供了理论基础。然而，突变菌株高产表型背后的机制往往仅限于表型观察，代谢网络的重构和关键酶系统的协调调节尚未得到充分阐明，从而限制了代谢工程设计的精确性。
DHA生物合成途径中关键代谢酶系统的活性和表达水平直接影响碳流分布和产物积累[14]。突变菌株的高产表型通常源于酶活性的改变或代谢通量的重新平衡；然而，ARTP诱变如何影响酶功能和全局调控网络的具体机制仍不清楚。因此，将代谢通量分析与酶动力学相结合，以阐明突变体的动态调控响应，不仅揭示了高产性状的分子基础，还为生物合成途径的合理优化提供了目标。
本研究以Aurantiochytrium属SW1为研究对象，采用ARTP诱变与三羧酸循环抑制剂（丙二酸）相结合，构建了一个双维度正向筛选平台用于突变体选择。通过将关键代谢酶系统与动态代谢模型耦合，建立了“诱变–酶系统响应–代谢通量调节”的闭环理论框架，系统分析了高产功能性脂质表型背后的代谢调节机制。这项研究有望支持复杂微生物代谢网络的合理重建，促进高效微生物细胞工厂的开发，从而推动海洋微生物资源在营养补充剂和制药领域的工业应用。
部分摘录
微生物和培养条件
本研究中使用的野生型菌株Aurantiochytrium属SW1（GenBank: KF500513）由马来西亚国民大学生物科学与生物技术学院微生物生理学实验室和山东工业大学Colin Ratledge微生物脂质中心提供。为了获得最佳的活性细胞菌落，Aurantiochytrium属SW1最初在SNA培养基（33 g/L营养琼脂和17.5 g/L海盐）上培养，培养基在121°C下高压灭菌
筛选诱变菌株
ARTP诱变育种的关键是确定最佳诱变剂量[25]。在本研究中，通过调整处理时间和丙二酸浓度优化了诱变参数。如图2A所示，菌株的致死率与ARTP处理时间呈正相关，在80秒时达到98.26%，符合最佳诱变标准（致死率≥95%）。因此，选择该参数进行后续筛选[26]。丙二酸干扰
结论
本研究构建了一个“诱变-酶系统响应-代谢通量调节”框架，用于分析高功能性脂质生产突变体的代谢调节系统。实验结果表明，与野生型菌株相比，经过ARTP处理的突变株的脂质产量增加了8.44%，DHA产量提高了20.89%，其抗氧化能力也得到了改善。进一步分析酶活性变化
CRediT作者贡献声明
Jianguo Chen：资源提供。Zitong Zhao：资源提供。Xuanwei Mei：写作–审稿与编辑。Yue Liu：写作–审稿与编辑。xiaojie Ren：写作–审稿与编辑、资金获取、数据管理。Feng Ji：实验研究。Xinhe Zhao：软件开发、资金获取、数据管理。Xu Wang：写作–初稿撰写、数据管理、概念构思
利益声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢山东省自然科学基金（ZR2020MC201和ZR2023MC194）以及山东省重点研发计划（2024TZXD050）的资助支持。
