Ednrb驱动的ET-1/RXFP1在TXA诱导的急性软骨损伤相关PTOA（疼痛、肿胀和活动受限）加重中起关键作用

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Ednrb-Driven ET-1/RXFP1 Underlies TXA-Induced Exacerbation of Acute Cartilage Injury-Related PTOA

本研究通过RNA测序、分子对接及细胞实验，揭示替卡西平激活内皮素受体B（Ednrb/ETB）通路，导致软骨降解和炎症的机制，提出靶向Ednrb可能防治创伤性骨关节炎。

　　

李明|任东|侯浩伟|卢健|任国伟|姚双全|耿琳丹|王鹏程

中国河北省石家庄市河北医科大学第三医院骨科二科

摘要

目的

研究内皮素受体B（Ednrb/ETB）在氨甲环酸（TXA）诱导的创伤后骨关节炎（PTOA）中的作用，并阐明其潜在的分子机制。

方法

将成年大鼠分为四组：对照组+TXA（T组）、软骨划伤+TXA（CT组）、软骨下骨折+TXA（ST组）以及软骨-软骨下骨折联合+TXA（CST组）。通过RNA测序结合Venn分析鉴定候选基因，包括Ednrb。进行分子对接实验以评估TXA与ETB之间的结合亲和力。随后对大鼠进行组织学、免疫组化和生化分析。ATDC5软骨细胞被转染si-Ednrb-1/2并联合TXA处理，以评估细胞活力和信号通路激活情况。

结果

RNA测序显示Ednrb在CT组和CST组中是上调的核心基因。分子对接实验表明TXA与ETB之间有很强的结合能力（结合能：–5.1 kcal/mol）。在大鼠PTOA模型中，TXA显著增加了NCT组和NCST组的OARSI评分（P < 0.0001），上调了ETB、基质金属蛋白酶13（MMP13）、RXFP1、内皮素-1（ET-1）、磷酸化核因子-kappa B和磷酸化AKT的表达，以及炎症介质白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素-6的表达。在ATDC5细胞中，Ednrb的敲低显著提高了细胞活力，减少了细胞凋亡，并下调了ETB、MMP13及相关信号通路分子，从而减轻了炎症反应。TXA处理显著逆转了这些保护作用。

结论

Ednrb在TXA诱导的PTOA进展中起关键介质作用。TXA与ETB的结合激活了松弛素和ET-1/ETB通路，从而促进软骨降解和炎症。靶向Ednrb可能是一种有前景的预防TXA相关PTOA的治疗策略。

引言

氨甲环酸（TXA）是一种合成的赖氨酸类似物[1]，广泛应用于多个医学领域，包括牙科、普通外科、妇科和创伤护理[2, 3]。TXA可逆地结合纤溶酶原和纤溶酶的赖氨酸结合位点，从而抑制它们与纤维蛋白的相互作用，发挥抗纤溶和止血作用。髋关节或膝关节置换手术常伴随超过500毫升的围手术期出血，而输血存在重大风险，包括输血反应和传染病传播[4]。TXA可通过口服、局部应用或静脉注射给药，已被证明能显著减少术中和术后出血。关节内给药比静脉注射具有更明显的局部止血效果。因此，术前或术中注射TXA被广泛用于减少全关节置换术和其他骨科手术（如韧带重建和关节镜手术）中的出血和术后肿胀[5, 6, 7, 8, 9]。尽管关节内TXA通常被认为是安全的，但仍对其潜在的局部毒性存在担忧[5, 10]。关于TXA体外软骨毒性的研究有限，其对关节内骨折和其他损伤关节表面后急性软骨损伤的影响仍不清楚。在关节手术中，TXA常直接应用于受损的软骨表面，关节内的浓度可能远高于系统给药时的浓度[7, 11, 12]。先前的研究表明，暴露于TXA（100 mg/mL）4小时会显著增加多种组织的细胞凋亡[13]，这引发了对其潜在软骨毒性的担忧。

人类的骨骼疾病，包括骨质疏松症（OP）和骨关节炎（OA），随着年龄的增长而显著增加，给老年人群带来了沉重负担[14, 15, 16]。OP可能促进OA的发展和进展[17]，几种OP疗法（包括雌激素、双膦酸盐和益生元）在OA模型或临床环境中显示出有益效果[18, 19, 20]。关节损伤是OA的公认风险因素，其特征是软骨、软骨下骨和其他关节组织的疼痛和进行性退化[21]。自1990年以来，全球OA的患病率增加了132%，预计到2050年将进一步增加60-100%，可能影响近10亿人[14]。创伤后骨关节炎（PTOA）在关节损伤后发生，约占OA病例的12%[22, 23]。这种脆弱性主要归因于关节软骨的有限再生能力，这是一种非血管性且自我更新能力较差的组织[24]。在OA的动物模型中，炎症细胞因子如C-C Motif趋化因子配体2（CCL2）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-33（IL-33）表达上调，促进了软骨降解酶（包括基质金属蛋白酶MMPs）和分解素及金属蛋白酶（ADAM）家族成员的表达。关节损伤和修复过程中这些介质的失调被认为推动了PTOA的进展[25]。Liu等人[26]证明，选择性清除衰老的软骨细胞可以减缓PTOA小鼠模型的疾病进展，而关节内注射衰老细胞则会诱发OA。虽然关节稳定手术可以恢复生物力学对齐并减少由于软骨和软骨下骨异常负荷引起的关节退化[27]，但围手术期干预（包括手术创伤和药物）可能导致关节组织的细胞和分子变化。因此，阐明关节损伤和围手术期治疗引发的生物学机制对于改进预防和治疗PTOA的策略至关重要[28, 29]。

TXA介导的软骨损伤的分子机制及其对PTOA进展的潜在贡献仍不甚清楚；然而，炎症和细胞外基质降解是PTOA发病机制的核心特征[30, 31]。促炎细胞因子（白细胞介素-1β [IL-1β]、肿瘤坏死因子α [TNF-α]、IL-6）和MMPs在受损关节中显著上调。此外，涉及内皮素-1（ET-1）和松弛素（RLX）的信号通路与软骨细胞功能障碍有关，已有报道TXA可抑制血管内皮细胞中的ET-1信号通路[32, 33, 34, 35]。本研究利用大鼠模型识别参与PTOA发病机制的核心基因。通过体外实验，我们通过评估细胞活力、细胞凋亡和PTOA相关通路的激活来分析潜在的分子机制。我们的发现旨在为TXA的软骨毒性机制提供新的见解，并确定预防PTOA的潜在治疗靶点。

部分摘要

大鼠关节软骨的RNA测序

所有实验均按照机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。使用骨骼成熟的12周龄雌性Wistar大鼠（河北医科大学实验室）来模拟不同的骨折情况。这些无菌雌性Wistar大鼠在无特定病原体的动物设施中出生和饲养，生活在12小时光照-黑暗周期的无菌环境中，位于河北医科大学第三附属医院动物实验中心

局部应用TXA后Ednrb上调并主要定位于软骨中

基于RNA测序分析，正常样本与实验组（T组、CT组、CST组和ST组）之间存在显著差异。样本根据疾病状态大致分组，共鉴定出1,834个上调基因和1,279个下调基因，其中软骨损伤组的变化最为明显（图1A）。对各实验组与对照组之间的DEGs进行Venn分析，发现CT组和CST组有57个重叠基因

讨论

本研究系统地阐明了Ednrb/ETB在TXA诱导的软骨损伤中的关键作用，揭示了一条涉及RLX-RXFP1和ET-1的新调控通路。在生理条件下，关节软骨细胞表达的ET-1很少，其表达主要在衰老或病理状态下增加。体外研究表明，升高的ET-1可诱导骨关节炎软骨细胞中MMPs（特别是MMP1和MMP13）的表达[41]。在我们的动物模型中，Ednrb表现出

CRediT作者贡献声明

李明：撰写——原始草稿，概念构思。任东：数据整理，概念构思。任国伟：监督，软件使用。姚双全：可视化，验证。侯浩伟：方法学。卢健：软件，资源准备。耿琳丹：验证，监督。王鹏程：撰写——审稿与编辑，可视化

伦理批准

所有动物实验均遵循《实验室动物护理和使用指南》进行，并获得了河北医科大学第三医院医学伦理委员会的批准（批准编号：Z2021-019-1）。伦理审查期为2021年12月24日至2022年12月24日。

数据可用性

数据将在收到相应作者的合理请求后提供。

利益冲突

作者声明在本研究中不存在利益冲突。

资助

中央政府地方科技和技术开发指导基金（基础研究项目）：216Z7708G。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。