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血红素通过级联催化生成胆绿素，采用一锅法共固定化重组血红素氧化酶（rHO）、细胞色素P450还原酶（rCPR）和葡萄糖脱氢酶（rGDH）粗酶与花青素及氨基磁纳米颗粒，制备磁性交叉酶聚集体（MCLEAs），显著提升热稳定性和pH稳定性，重复使用性良好，10分钟内产胆绿素0.70 μM。
Xiyuan Tang|Meiying Zhu|Zhipeng Liu|Longyu Zhang|Chengli Yang|Jian Zhang|Zhaohui Liu|Dali Li
南京理工大学环境与生物工程学院，中国南京
摘要
固定化酶技术因其能够提高酶的稳定性和重复使用性而得到广泛应用。然而，传统方法依赖于高纯度的酶，这涉及繁琐的提取步骤和高成本，从而限制了其实际应用。近年来，基于粗酶的直接固定化策略因其经济性和高效性而受到关注。本研究开发了一种一锅法共固定化策略，将重组细胞色素P450还原酶（rCPR）、重组葡萄糖脱氢酶（rGDH）和重组血红素加氧酶（rHO）与Genipin和胺化的磁性纳米颗粒混合，制备出用于血红素到胆绿素级联催化的磁性交联酶聚集体（MCLEAs）。固定化后，rCPR、rGDH和rHO的固定化效率分别达到了64.3%、70.6%和95.2%。rCPR、rGDH和rHO的活性恢复率分别达到了105.0%、65.0%和120.0%。MCLEAs中的酶的热稳定性和pH稳定性得到了显著提高，同时实现了优异的重复使用性和储存稳定性。经过7次催化循环和30天的储存后，MCLEAs的剩余活性分别保持了50.0%和35.3%。该级联系统显著增强了rHO的催化性能，在10分钟的反应时间内产生了0.70μM的胆绿素。本研究为复杂酶系统的简单固定化和高效应用提供了一种新策略。
引言
酶是一类具有高效催化能力的大分子生物分子，其催化效率远超化学催化剂，并且具有高特异性和温和反应条件等优点[1]、[2]、[3]。在工业应用中，酶被广泛应用于食品加工[4]、药物合成[5]、生物燃料生产[6]和环境修复[7]等领域。然而，游离酶对环境条件非常敏感[8]，高温、极端pH值或有机溶剂容易破坏其空间结构，导致不可逆失活[9]。此外，游离酶难以回收和重复使用[10]，这大大增加了生产成本，限制了其大规模应用[11]。此外，酶的研究和应用依赖于纯化酶[12]，这无疑带来了高昂的纯化成本[13]。固定化酶技术在一定程度上可以克服游离酶的局限性[14]。一方面，这种方法具有显著优势。固定化增强了酶结构的刚性，从而显著提高了其对变性的热稳定性和操作稳定性，并且便于将生物催化剂从反应混合物中分离出来，实现重复使用和连续操作，从而大幅降低了工业成本[15]。另一方面，固定化不可避免地引入了一些缺点。酶与载体之间的相互作用可能导致构象变化，从而阻塞活性位点，导致活性降低。因此，固定化技术不断发展，旨在最大化稳定性和可回收性的同时，尽量减少活性损失和扩散限制[16]、[17]、[18]。
物理固定化方法简单温和，但在极端条件下可能导致酶泄漏[19]，而化学固定化方法（例如共价交联）由于结合强度增强而更加稳定。交联酶聚集体（CLEAs）是一种简单高效的无需载体的固定化策略，其中酶分子沉淀成物理聚集体，然后通过双功能试剂（例如戊二醛或Genipin）进行交联，形成不溶性的生物催化剂[20]。这种方法保持了酶的高局部浓度，从而提高了催化性能。此外，交联网络内的限制效应有助于提高酶的稳定性[21]。然而，传统的CLEAs通常具有不规则的形态、宽的尺寸分布和较差的机械强度，导致破碎和处理和回收困难[22]。已经开发出了一些先进的策略来克服这些限制。例如，加入磁性纳米颗粒有助于分离和稳定性[23]、[24]；通过碳酸钙模板制备的酶微球提高了稳定性[25]。这些创新共同提高了CLEAs的可回收性和工业可行性。
多酶级联催化作为一种强大且高效的生物合成策略[26]，将多个酶促反应步骤整合到一个系统中，实现了中间体的即时转化。这有效防止了不稳定或有毒中间体的积累，显著提高了工艺安全性和整体效率[27]。然而，依赖于游离酶随机混合的传统多酶级联反应存在中间体扩散损失和转移效率低的问题，这限制了催化性能。为了解决这些问题，已经广泛开发了多酶共固定化策略。例如，Tsujimura等人报道了乳酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶和醛脱氢酶在电极上的共固定化，通过级联反应生成多个电子[28]。Cao等人报道了甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶和酒精脱氢酶分别固定在水凝胶颗粒中，从CO2中生成甲醇[29]。Chen等人报道了Rhizomucor miehei脂肪酶作为CLEAs固定化，高效合成1,3-二油酰-2-棕榈酰甘油，用于婴儿配方[30]。通过调节空间组织、缩短酶间距离、构建底物通道和优化底物转移路径，这些策略大大提高了级联效率[31]。研究表明，这种模仿天然多酶复合物的自组装方法能够实现底物通道效应和协同催化机制，从而显著提高了各种代谢途径的效率[32]。这为高效酶催化系统的合理设计提供了重要方向。
胆绿素IXα（BV）是一种线性四吡咯化合物，通过血红素（heme）的降解产生[33]，这一过程由血红素加氧酶（HO）催化。BV因其抗炎和抗氧化特性而受到广泛关注，在器官移植、伤口愈合、病毒感染、阿尔茨海默病和糖尿病等领域显示出有益效果[34]。HO是一种主要存在于肝脏、脾脏和大脑等组织中的微粒体酶，其功能是催化血红素分子的α-甲基桥的氧化断裂。该反应是一个多步骤、能量依赖的过程，需要分子氧（O?）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为辅因子，并依赖于NADPH-细胞色素P-450还原酶系统（NADPH-CPR）提供电子[35]。具体来说，HO首先与heme-Fe（III）结合形成酶-底物复合物，然后通过NADPH-CPR提供的电子还原为Fe（II）状态。随后，氧气与这个复合物结合，形成活性氧中间体，进一步氧化heme的α-甲基桥，生成α-甲基羟基血红素。这个中间体释放出一氧化碳（CO），形成胆绿素中间体。最后，在NADPH-CPR的持续电子供给和氧气的参与下，胆绿素中间体进一步裂解，释放出亚铁离子（Fe2?），最终生成BV[36]。在整个反应过程中，HO和NADPH-CPR形成一个级联系统，每个降解的血红素分子产生等量的BV、CO和Fe2?[37]。这一途径不仅对血红素代谢至关重要，也是体内抗氧化防御、抗炎反应和气体信号分子生成的关键机制。
氧化还原酶作为生物催化过程中的关键参与者，通常依赖于辅酶NAD(P)?或NAD(P)H的参与。然而，这些辅酶的高成本显著增加了反应费用，严重限制了氧化还原酶在大规模工业过程中的广泛应用[38]。因此，出现了辅酶再生技术。两种常用的NAD(P)H再生酶是葡萄糖脱氢酶（GDH）和甲酸脱氢酶[39]。GDH因其能够使用廉价的D-葡萄糖将NAD?还原为NADH，NADP?还原为NADPH而受到广泛关注[40]。
本研究利用重组血红素加氧酶（rHO）、重组细胞色素P450还原酶（rCPR）和重组葡萄糖脱氢酶（rGDH）构建了一个多酶级联反应。使用Genipin作为交联剂，胺化的磁性纳米颗粒（nano-Fe3O4-NH2）作为磁性核心，从细胞裂解物中直接一步固定了这些粗酶，制备出MCLEAs。所得的MCLEAs被用于通过级联反应生成BV。系统评估了各种参数的影响，包括温度和pH对酶活性、储存稳定性、重复使用性以及游离和固定化的rHO、rCPR和rGDH的动力学参数。
材料
细胞色素c从Mucklin有限公司（中国上海）购买。NADPH从Meryer有限公司（中国上海）获得。D-葡萄糖由Sinopharm Chemical Reagent有限公司（中国上海）提供。NADP?和抗坏血酸从Aladdin有限公司（中国上海）购买。血红素从Rhawn有限公司（中国上海）购买。牛血清白蛋白（BSA）从Huixing Chemical Reagent有限公司（中国上海）获得。Genipin的制备方法如下
MCLEAs的制备
我们准备了MCLEAs以完成级联反应，反应方案如图1所示。反应从rGDH利用葡萄糖和NADP?生成NADPH开始。生成的NADPH作为rCPR的电子供体，然后通过FAD和FMN依次将电子传递给rHO-heme复合物。在氧气存在下，血红素经过α-甲基羟基血红素和胆绿素的系列转化，同时生成CO、H2O和Fe2+
结论
本研究采用了一锅法直接从粗酶混合物中制备了由rCPR、rGDH和rHO组成的固定化多酶复合物，用于血红素到BV的生物催化级联转化。制备的MCLEAs表现出高的酶活性恢复率和显著的酶耐受性。级联反应在10分钟的催化时间内产生了0.70μM的BV。因此，本研究为rCPR、rGDH的共固定化提供了一种直接的方法
CRediT作者贡献声明
Longyu Zhang：软件支持。Chengli Yang：项目管理、概念构思。Jian Zhang：可视化。Zhaohui Liu：数据管理。Zhipeng Liu：数据管理。Xiyuan Tang：撰写——初稿、验证、正式分析。Meiying Zhu：实验研究。Dali Li：撰写——审阅与编辑、监督。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Dali Li报告称得到了南京理工大学的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
