《Biochemical Engineering Journal》：Enhanced Monensin Biosynthesis in
Streptomyces cinnamonensis with Multigene Integration and Overexpression of Newly Identified Genes
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提高肉桂色链霉菌产恩倍定的代谢工程策略研究，通过多基因整合优化碳代谢、前体合成、ATP供应、抗逆及聚酮合成模块，使发酵罐中恩倍定产量达26.2g/L，较原菌种提升109%。
邢浩波|清明后|王振华|张善飞|宋尚霞|杜露露|高成华|李云飞|孙福宝
教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物技术学院，中国无锡214122
摘要
莫能菌素是一种由Streptomyces cinnamonensis产生的聚醚类抗生素。由于其复杂的生物合成途径，关键生物合成基因的表征不完整，长期以来一直阻碍着莫能菌素工业生产的改进。基于我们之前的转录组分析，该分析首次在一种高产S. cinnamonensis菌株中鉴定了参与莫能菌素生物合成的关键基因，本研究通过多基因整合策略对该菌株进行了代谢工程改造，针对初级代谢、前体合成、ATP供应、抗逆性和莫能菌素生物合成基因簇进行了优化。结果表明，共表达磷酸果糖激酶（pfk）、柠檬酸合酶（cs）、甲基丙二酰辅酶A变位酶β亚基（mutB）和甲基丙二酰辅酶A变位酶（mcm）后，莫能菌素的浓度从12.6 g/L提高到了20.2 g/L，相比原始菌株提高了约60%。共表达ATP合酶β亚基（assβ）、真菌硫醇偶联酶（mac）和莫能菌素生物合成酶（monE）后，莫能菌素的浓度从12.6 g/L提高到了19.4 g/L，增幅超过50%。此外，使用新型pKHBT1系统同时共表达这七个基因后，在5升发酵罐中的莫能菌素浓度提高到了26.2 g/L，是原始菌株的两倍多。这些新鉴定的关键代谢基因确实与S. cinnamonensis中的莫能菌素生物合成密切相关，为提高莫能菌素生产效率的代谢工程提供了线索。
引言
莫能菌素是由Streptomyces cinnamonensis通过发酵产生的聚醚类抗生素[1]，[2]。由于其高效性、低毒性和较低的耐药性发展倾向，莫能菌素被广泛用作兽药和饲料添加剂[3]。然而，目前S. cinnamonensis中莫能菌素的生产效率仍不足以满足畜牧业日益增长的需求[4]。随着微生物代谢工程和合成生物学等前沿生物技术的快速发展，通过有针对性的代谢工程策略合理优化关键基因和代谢模块以实现高效莫能菌素生产已成为可能。
目前，抗生素的工业生产主要通过代谢途径改造和发酵优化来实现[5]。近年来，如初级代谢、前体合成、ATP生成和抗逆性等生物合成途径的功能性定义代谢单元已成为提高抗生素产量的有效策略[6]。例如，Lee等人[7]通过增强Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径和重组碳代谢，促进了乙酰辅酶A的积累，为莫能菌素等产品的生产提供了关键前体。Ryu等人[8]通过过表达乙酰辅酶A羧化酶亚基（accA2、accB、accE），增强了丙二酰辅酶A的合成，使肌动蛋白的产量提高了六倍。Huang等人[9]证明，优化ATP合酶的β亚基可以改善细胞能量代谢，增强ATP生成能力，并在不利条件下提高细胞存活率。Lennicke等人[10]发现细胞色素氧化酶亚基I（coxI）在维持膜完整性和缓解环境压力方面起着重要作用。这些以功能为导向的工程策略在不同程度上优化了代谢途径并促进了代谢产物的积累。然而，大多数研究仅关注单个模块的改造，很少以协调组合的方式整合多个功能单元的目标，从而限制了目标产品的大规模积累。为了进一步推进莫能菌素的工业生产，我们的研究小组之前对一种高产S. cinnamonensis菌株进行了转录组分析，初步阐明了其生物合成途径并鉴定了关键基因[11]。然而，这一策略尚未得到系统的实施。
另一方面，莫能菌素的生物合成主要由其生物合成基因簇决定，该基因簇包含八个编码聚酮合酶（PKS）的开放阅读框[12]，[13]。Zhang等人[11]在对高产野生型S. cinnamonensis的分析中发现，该基因簇的表达显著上调，进一步证实了其关键作用。Oliynyk等人[14]通过过表达调控基因monRⅠ有效提高了莫能菌素的合成水平。Tang等人[15]证明，使用独立整合的质粒共表达两个调控基因monRⅠ和monRⅡ后，莫能菌素的浓度提高了1.13 g/L，增幅超过70%。因此，针对该基因簇的调控被认为是莫能菌素工业生产的重要策略。
在这项研究中，我们采用基于功能单元的多目标基因共表达策略结合多位点染色体整合技术，旨在改造S. cinnamonensis中的莫能菌素生物合成。我们首先将关键生物合成途径分为五个功能模块：初级代谢、前体供应、ATP生成、抗逆性和莫能菌素生物合成簇。需要注意的是，这些模块代表的是功能定义的代谢单元，而不是传统意义上的动态平衡工程模块。通过单独验证每个模块，我们确定了在每个功能类别中对莫能菌素生产贡献最大的关键基因，并逐步将这些基因整合在一起，以促进协同代谢流。此外，我们建立了一个基于双位点染色体整合的多基因共表达平台，实现了来自多个功能单元的优化基因的同时整合。这种整合策略显著提高了莫能菌素的产量。最终，工程菌株在摇瓶和5升发酵罐中的生物质积累和莫能菌素合成水平均得到了提升。总体而言，这项工作为莫能菌素的高效生物合成提供了一个可扩展的技术平台。
章节片段
菌株、质粒和材料
本研究中使用的菌株和质粒列于表S1中。S. cinnamonensis M6002菌株保存在我们的实验室中。Escherichia coli菌株在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养。E. coli JM109用于分子克隆。E. coli ET12567用于接合实验。Apramycin（Apr）、hygromycin（Hyg）和nalidixic acid购自Aladdin（上海，中国）。其他实验试剂购自Sangon Biotech Co., Ltd.（上海，中国）。
通过EMP/TCA途径优化碳流以提高莫能菌素产量
莫能菌素的生成需要大量的乙酰辅酶A作为关键前体[17]。EMP途径是S. cinnamonensis中生成乙酰辅酶A的主要途径[18]。基于转录组分析，确定了EMP途径中的四个关键调控节点：葡萄糖激酶（glk）、磷酸果糖激酶（pfk）、磷酸葡萄糖异构酶（pgi）和丙酮酸脱氢酶（pdh），这些基因都是该途径的关键基因（图1A）。随后，对这些关键基因进行了...
结论
通过多基因整合系统，成功地对一种高效的莫能菌素生产菌株进行了代谢工程改造。首先，加强了初级代谢和前体供应模块，有效将中心碳流重新导向莫能菌素生物合成途径。接着，通过整合ATP供应、抗逆性和莫能菌素生物合成模块，进一步提高了发酵的稳定性和菌株的生物合成能力。此外，通过开发新的...
CRediT作者贡献声明
孙福宝：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、资金筹集。邢浩波：撰写——初稿撰写、数据可视化、软件使用、实验设计、数据分析、数据管理。杜露露：资源获取、资金筹集、数据管理。高成华：方法设计、数据管理。宋尚霞：软件使用、资金筹集、数据管理。李云飞：监督、资源获取、项目管理。王振华：数据可视化、资源获取、方法设计、数据分析。张善飞：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
