《Biochemical Journal》：Structural basis for inhibition of SpyCas9 by the anti-CRISPR protein AcrIIA26
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为解决噬菌体如何对抗细菌的CRISPR-Cas9免疫系统这一关键科学问题，研究人员围绕AcrIIA26抑制SpyCas9的分子机制开展研究。通过解析3.0 ?分辨率的冷冻电镜结构，发现AcrIIA26采用独特的折叠，通过模拟双链DNA的5-螺旋束占据PAM识别位点，同时利用4-螺旋束结合Cas9的REC结构域，立体阻碍其激活所必需的构象变化，从而实现对Cas9的双重抑制。该研究揭示了PAM识别是Cas9功能的关键脆弱点，为设计更优的Cas9“关闭开关”以改善基因组编辑应用提供了结构基础。
在微观世界中，细菌与噬菌体之间进行着一场永无止境的“军备竞赛”。细菌演化出了强大的CRISPR-Cas适应性免疫系统，能够像精确制导的导弹一样，识别并切割入侵的噬菌体DNA。作为反击，噬菌体则进化出小巧而高效的“反导系统”——抗CRISPR（Anti-CRISPR, Acr）蛋白，用以抑制Cas蛋白的功能，逃避免疫清除。这些Acr蛋白种类繁多，但大多机制不明，犹如隐藏的“特工”，阻碍着我们对这一精密防御系统的深入理解。其中，AcrIIA26是一种能抑制化脓性链球菌Cas9（SpyCas9）DNA结合能力的II-A型Acr，但其具体如何“锁死”Cas9，一直是个未解之谜。理解这些Acr的抑制机制，不仅是揭示生命进化“军备竞赛”的关键，也为在应用层面精确控制CRISPR-Cas9这把“基因剪刀”提供了可能，特别是为了解决其“脱靶效应”这一临床应用的主要障碍。
为了阐明AcrIIA26的抑制机制，研究人员展开了系统的研究。他们成功解析了AcrIIA26与装载了单链向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）的SpyCas9所形成的复合物的冷冻电镜结构，分辨率达到3.0 ?。通过结合生化突变分析，揭示了AcrIIA26采用了一种前所未有的双重抑制策略，有效地将Cas9“冻结”在非活性状态。这项重要的研究成果发表在《Biochemical Journal》上。
研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：首先，利用分子克隆技术构建了带有His标签的AcrIIA26及其突变体的表达载体，并在大肠杆菌中进行蛋白质表达与纯化，通过镍柱亲和层析和尺寸排阻色谱获得高纯度蛋白。其次，通过体外DNA切割实验，评估了AcrIIA26及其关键位点突变体对SpyCas9切割活性的抑制效果，验证了其功能。最关键的是，利用单颗粒冷冻电子显微镜技术，对预先形成的SpyCas9-sgRNA-AcrIIA26复合物进行样品制备、数据收集与处理，最终解析了其高分辨率三维结构。此外，还使用了AlphaFold3进行结构预测辅助建模，并通过局部细化技术提升了柔性区域（如HNH结构域）的密度图质量。
研究结果
AcrIIA26与SpyCas9-sgRNA复合物的结构
研究人员首先证实了纯化的AcrIIA26能以浓度依赖的方式抑制SpyCas9的DNA切割活性。随后，他们利用冷冻电镜解析了复合物结构。AcrIIA26具有一种全新的折叠方式：一个中心五链反平行β-片层，两侧分别是一个五α螺旋束（5-helix bundle）和一个四α螺旋束（4-helix bundle），整体形状像一把弓。其分子表面呈高度酸性。值得注意的是，5-螺旋束带负电的表面形状
