Nanoplex簇介导的树突状细胞与T细胞的协同调节作用增强了肿瘤特异性适应性免疫

《Biomaterials》：Nanoplex cluster-Mediated Synergistic Modulation of Dendritic Cells and T Cells Amplifies Tumor-Specific Adaptive Immunity

双纳米多聚体簇通过点击化学结合CpG和CTLA-4 siRNA，利用MMP-2裂解实现肿瘤靶向递送，增强树突状细胞激活和免疫检查点阻断，有效逆转肿瘤微环境并抑制肿瘤生长。

　　

魏茂|朴妍珠|金松来|周星妍|郑英美|金善华|俞赫桑

摘要

肿瘤的免疫逃逸在很大程度上受到免疫检查点分子的影响，这些分子会阻碍共刺激信号的激活。共刺激分子的不足限制了免疫系统对恶性肿瘤产生强烈反应的能力。本研究开发了一种双纳米复合物（NC）配方，有效克服了这些问题。该配方包含一种封装了CpG ODN 1826（CpG NP）的纳米复合物，这种复合物可以刺激TLR-9并提高抗原呈递细胞上的CD80/86共刺激分子的水平；另一种纳米复合物则含有CTLA-4 siRNA（siCTLA-4 NP），能够抑制T细胞上免疫检查点分子CTLA-4的产生。这两种纳米复合物通过含有叠氮基团（AZ）的纳米复合物与MMP-2可切割肽（APA）两端的炔基团进行环加成反应，从而形成NC。NC的形成过程经过优化，使其具有柔韧性和可变形性，同时保持适当的大小，以实现最大的被动黑色素瘤积累效果，并维持全身稳定性，同时表现出肿瘤内的可切割性和显著的肿瘤抑制效果。对脾脏和肿瘤中细胞组成的体外研究，以及对脾细胞的肿瘤特异性抗原刺激实验表明，NC治疗可以将免疫抑制的肿瘤微环境转变为免疫活性状态。这些发现表明，我们的NC配方通过结合CTLA-4抑制和树突状细胞（DC）刺激，增强了针对肿瘤组织的免疫反应，为癌症免疫治疗领域提供了新的见解和潜在应用。

引言

近年来，免疫疗法作为一种有前景的肿瘤治疗方法出现，旨在利用免疫细胞触发特定的适应性免疫反应。这种方法涉及靶向递送肿瘤相关抗原（TAAs）和/或适当的佐剂。[1]，[2] 尽管取得了进展，但由于肿瘤进展过程中形成的免疫抑制性肿瘤微环境（TME），TAA/佐剂在引发强烈免疫反应方面的有效性仍然不足。免疫抑制细胞，包括调节性T细胞（T_reg）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和髓系来源的抑制细胞（MDSCs），以及免疫检查点如细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）和程序性死亡1（PD-1）/PD配体1（PD-L1）轴，共同导致了宿主免疫系统的免疫监视功能受损。[3]，[4]，[5]，[6] 在这些免疫检查点中，CTLA-4作为一种共抑制因子，与共刺激分子CD28竞争结合到专业抗原呈递细胞（APCs）上的B7（CD80和CD86）上，从而导致对恶性肿瘤的免疫反应减弱。[7]

为了防止CTLA-4耗尽共刺激分子B7，同时增强共刺激信号向CD8⁺细胞毒性T细胞（CTLs）的传递，从而促进抗肿瘤免疫，抗CTLA-4单克隆抗体（mAbs）被广泛用于阻断CTLA-4。商业化的抗CTLA-4 mAbs，包括伊匹单抗（ipilimumab）和特雷姆利单抗（tremelimumab），在临床试验中通过阻断CTLA-4免疫检查点并增强T细胞介导的抗癌反应显示出显著的效果。[8]，[9] 尽管已经建立了药代动力学、证明了临床疗效和标准化的给药方案，但抗CTLA-4 mAbs仍与严重的免疫相关不良事件（irAEs）相关，这些不良事件是由于特异性不足和全身免疫激活引起的，包括过敏反应和类过敏反应，以及多器官毒性。[8]，[10]，[11]，[12]，[13] 与抗CTLA-4 mAbs相比，CTLA-4 siRNA提供了一种基因沉默策略，能够更精确地调控CTLA-4的表达，具有短暂的CTLA-4敲低效果，并降低了脱靶效应和irAEs的风险。然而，siRNA疗法仍面临诸如体内不稳定性、递送不足、缺乏先天免疫激活以及临床应用有限等挑战。当与定制的递送技术（如肿瘤靶向载体封装）结合使用时，CTLA-4 siRNA在体内应用中展现出潜力，从而在癌症免疫治疗中实现更安全、更可控和更局部的免疫调节。[14]，[15] 最近关于将含有siCTLA-4的纳米颗粒递送到肿瘤或淋巴结的研究证实，抑制活化T细胞上的CTLA-4表达可以显著减少T细胞耗竭并保持T细胞功能。这些配方通过静脉（i.v.）或皮下（s.c.）注射在体内给药，有效靶向肿瘤浸润或淋巴结驻留的T细胞，引发强烈的肿瘤特异性免疫反应。[16]，[17]

通过增强共刺激分子的表达，也可以提高抗肿瘤免疫疗法的效果。CpG寡脱氧核苷酸（ODN）是最被广泛研究的Toll样受体9（TLR9）激动剂，常被用作TAAs的佐剂以产生协同效应。[18] 然而，CpG ODN即使在缺乏TAAs的情况下也能刺激DCs的激活和成熟。[19] 多项研究表明，CpG ODN单独使用就足以抑制多种类型的肿瘤生长，包括小鼠宫颈癌和纤维肉瘤。[20]，[21] 此外，在CTLA介导的抗肿瘤免疫疗法中，同时递送TLR9激动剂和抗CTLA-4 mAb可以减轻T细胞的免疫抑制。[22]，[23] CpG和抗CTLA-4 mAb的协同作用延长了患者的生存时间，提高了生存率，并激活了CD8⁺ T细胞、NK细胞和DCs等免疫细胞，从而诱导抗肿瘤免疫反应。

在本研究中，我们设计并研究了一种基于双纳米复合物的NC系统，该系统在肿瘤微环境（TME）中抑制免疫检查点的同时增强免疫反应，以增强抗肿瘤免疫疗法的效果。与传统免疫疗法中使用的共递送系统不同，我们的平台实现了结构创新，利用原位可切割的NC来解决“递送-效果悖论”，结合了大规模的肿瘤积累稳定性和触发解离以实现深层组织渗透。此外，全核酸平台确保了化学上的统一封装和同步的细胞内递送。NC是通过点击化学将两种不同的NP成分：CpG NP和siCTLA-4 NP连接起来制备的。使用聚乙二醇-叠氮基接枝的分支聚乙烯亚胺（bPEI-PEG-AZ）作为载体，将核酸（NAs）浓缩成NP。NP上的AZ基团可以与MMP-2可切割肽连接器两端的炔基团通过铜(I)催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）反应，形成更大尺寸的NC，从而增强被动TME靶向效果。NC最初通过尺寸效应实现肿瘤积累和保留；随后，NC通过MMP-2介导的切割分解成较小的亚单位，包括NP单体和寡聚体，从而实现更深入的肿瘤渗透。CpG NP亚单位促进DCs成熟并增加B7表达，而siCTLA-4 NP亚单位则抑制CTLs上的CTLA-4，共同通过促进共刺激信号传导诱导的CTL激活来增强肿瘤特异性适应性免疫。

材料

分支聚乙烯亚胺（bPEI，分子量25 kDa）、抗坏血酸钠和荧光素购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州路易斯）。硫酸铜（II）购自Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯州）。叠氮PEG琥珀酰亚胺羧甲基酯（SCM-PEG-AZ，分子量3.5 kDa）购自JenKem Technology（美国德克萨斯州）。炔基-PEG4-马来酰亚胺购自Conju-Probe（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。DBCO-Cy3购自FutureChem（韩国首尔）。十二钨（VI）

结果与讨论

NC是通过点击化学方法组装的（图1a）。具体来说，阴离子NA（CpG或siCTLA-4）通过静电相互作用与bPEI-PEG-AZ的阳离子bPEI段结合形成NP，然后使用优化后的摩尔比，通过NP暴露的叠氮基团与MMP-2可切割肽两端的炔基团之间的点击化学反应来制备NC。分支PEI-PEG-AZ由阳离子bPEI骨架组成，

结论

总之，我们的研究展示了制备了包含CpG1826的纳米复合物用于树突状细胞（DC）激活，以及包含siCTLA-4的纳米复合物用于抑制活化CTLs上的CTLA-4免疫检查点。这些NP是通过bPEI-PEG-AZ与相应NA之间的静电相互作用形成的，并通过使用MMP-2可切割肽连接器通过CuAAC组装成适当尺寸的NC。这使得被动肿瘤靶向和双重功能NA的递送成为可能，改变了肿瘤微环境。

CRediT作者贡献声明

周星妍：指导。郑英美：指导。金善华：指导、研究。俞赫桑：撰写——初稿、指导。魏茂：撰写——初稿、方法学。朴妍珠：方法学。金松来：方法学

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：俞赫桑报告称获得了韩国国家研究基金会的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了科学和ICT部（RS-2025-02073096和RS-2024-00339160）和教育部（RS-2023-00271205）的资助。

缩写

NC：

双纳米复合物

NP：

纳米复合物

CpG NP：

CpG寡脱氧核苷酸1826纳米复合物

siCTLA-4：

细胞毒性T淋巴细胞抗原4 siRNA纳米复合物

AZ：

叠氮基团

MMP：

基质金属蛋白酶

APA：

炔基-MMP-2可切割肽-炔基

TAA：

肿瘤相关抗原

TME：

肿瘤微环境

T_reg:

调节性T细胞

TAM：肿瘤相关巨噬细胞

MDSC：髓系来源的抑制细胞

PD-1：程序性死亡1

PD-L1：程序性死亡配体1

APC：抗原呈递细胞

DC：树突状细胞

CTL：CD8⁺细胞毒性T细胞

mAb：