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本文揭示了一种新型肿瘤原位免疫疗法——维杜托利莫（Vidu，一种装载TLR9激动剂的病毒样颗粒）发挥作用的关键机制。研究发现，其激活肿瘤免疫依赖于抗体（anti-Qβ）的包被，而抗体包被的Vidu被关键的免疫细胞——浆细胞样树突状细胞（pDC）摄取，主要通过其特异性受体BDCA2（而非传统的FcγR）介导。有趣的是，抗体的浓度决定了BDCA2的作用方向：适度浓度促进pDC活化和I型干扰素（IFNα）产生，而过高浓度则导致BDCA2过度内化，反而抑制pDC活化，呈现“金发姑娘效应”。这为优化pDC靶向的免疫治疗纳米颗粒设计提供了重要见解。
背景
肿瘤免疫疗法，如免疫检查点阻断，已深刻改变了癌症治疗格局。然而，许多患者对此类疗法无应答。肿瘤内缺乏干扰素（IFN）特征与较低的应答率相关。一种克服耐药性并激发更强IFN应答的策略是原位免疫，即通过瘤内直接注射免疫刺激剂来增强局部IFN反应。
浆细胞样树突状细胞（pDC）是一类稀有但至关重要的细胞亚群，它们通过内体Toll样受体（如TLR9）感知病毒或细菌核酸后，能产生大量I型干扰素，包括IFNα。维杜托利莫（Vidu）就是这样一种TLR9激动剂。Vidu是一种由Qβ噬菌体外壳蛋白组装而成的病毒样颗粒（VLP），内部封装着名为G10的CpG-A ODN TLR9激动剂。Vidu在体外能有效激活pDC产生IFNα，在动物模型和早期临床试验中，瘤内注射也显示出有前景的治疗效果。值得注意的是，Vidu激活pDC并诱导抗肿瘤反应的能力，依赖于其被针对VLP Qβ外壳蛋白的特异性抗体（anti-Qβ）所包被。因此，首次注射Vidu几乎不产生免疫效应，其主要作用是诱导机体产生anti-Qβ抗体。真正的抗肿瘤免疫反应始于第二次注射，此时Vidu被anti-Qβ抗体调理，从而得以被pDC摄取和激活。
长期以来，人们认为pDC在某些条件下表达CD32（FcγRII），因此推测anti-Qβ包被的Vidu被pDC摄取是由Fcγ受体（FcγR）介导的。然而，基于更精确鉴定技术的最新证据表明，新鲜分离的pDC几乎不表达经典的FcγR（CD16、CD32、CD64），这提示可能存在其他受体参与其中。BDCA2（CD303）是一种在pDC膜上独特且稳定表达的受体。已知通过BDCA2的信号传导会阻断pDC对TLR配体的IFNα反应，这使得抗BDCA2抗体成为抑制自身免疫中pDC活化的潜在免疫抑制剂。有趣的是，BDCA2能够识别、结合并内化IgG、IgA和IgM的Fc区糖基化部分，这表明它可能作为pDC上的一种替代性FcγR发挥作用。这引出了一个关键问题：BDCA2是否作为pDC摄取anti-Qβ包被Vidu的受体，并在其免疫刺激效应中发挥作用？
材料与方法
研究使用来自健康供体的外周血单个核细胞（PBMC）。通过多色光谱流式细胞术和成像流式细胞术，表征了anti-Qβ调理的、荧光标记的Vidu（Vidu-AF647）与pDC及其他免疫细胞亚群的结合与摄取情况。评估了pDC经不同处理后IFNα的分泌和分化标志物表达，以确定哪些pDC膜蛋白参与了Vidu的摄取和pDC的激活。实验中使用了针对pDC表面抗原BDCA2和BDCA4的单克隆抗体，以及针对FcγR（CD16、CD32、CD64）的多克隆抗体进行阻断实验。通过ELISA检测培养上清中的IFNα水平。使用IDEAS软件分析成像流式数据，量化Vidu-AF647的内化分数和BDCA2的内化情况。
结果
- 1.
Anti-Qβ促进Vidu与所有免疫细胞群的结合：流式细胞术分析显示，在没有anti-Qβ存在时，所有CD45+细胞亚群与Vidu-AF647的结合水平都较低。加入anti-Qβ后，所有亚群的结合均显著增加。单核细胞（CD14+）的结合比例最高，而T细胞（CD3+）的结合有限。anti-Qβ还显著增加了粒细胞（CD15+）和自然杀伤细胞（CD56+）中Vidu-AF647+细胞的频率。
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- 2.
Vidu与pDC的结合及激活需要Anti-Qβ，并由CD32和BDCA2介导：Anti-Qβ显著增强了Vidu与pDC的结合（频率和中位荧光强度均增加）。阻断CD32对anti-Qβ包被Vidu与pDC结合的影响较小且具有时间依赖性，在2小时时影响微弱，在20小时时可显著降低结合频率约15%。相比之下，阻断BDCA2在2小时时对结合频率有轻微影响（约降低6%），但在20小时时影响增大至16%。更重要的是，阻断BDCA2在功能上比阻断CD32更能有效抑制pDC产生的IFNα，并阻碍pDC从未成熟的P0亚群（PDL1-CD80-）向产I型IFN的P1亚群（PDL1+CD80-）分化。同时阻断CD32和BDCA2对pDC与Vidu相互作用的抑制效果强于单独阻断任一受体。
- 3.
BDCA2对anti-Qβ调理的Vidu被pDC内化至关重要：使用多光谱成像流式细胞术评估Vidu在pDC内的定位。结果显示，与同型对照相比，抗BDCA2抗体能更显著地降低pDC对anti-Qβ包被Vidu的内化（平均内化分数降低45%），而抗CD32抗体的效果较弱（降低27%）。这表明BDCA2在pDC内化Vidu的过程中扮演了核心角色。
- 4.
高浓度Anti-Qβ包被的Vidu诱导BDCA2内化：已知BDCA2的交联会诱导其内化，进而触发抑制TLR刺激的级联反应。实验证实，可溶性TLR9激动剂G10与递增浓度的抗BDCA2抗体共处理时，BDCA2的内化程度呈剂量依赖性增加，同时IFNα的产生被抑制。接下来，研究人员用固定量的Vidu和递增浓度的anti-Qβ孵育PBMC。结果表明，随着anti-Qβ浓度从1 μg/ml增加到80 μg/ml，BDCA2的内化程度逐步增加，在20 μg/ml和80 μg/ml时达到最高。与之对应的是，IFNα反应在anti-Qβ浓度为5 μg/ml时达到峰值，此时BDCA2内化程度适中；当anti-Qβ浓度更高（20-80 μg/ml）时，IFNα反应逐步下降。这些数据揭示了anti-Qβ浓度、BDCA2内化和IFNα反应之间的“金发姑娘效应”：anti-Qβ浓度过低，Vidu摄取不足，TLR9激活弱，IFNα产量低；浓度适中时，Vidu摄取充分，BDCA2内化水平低，IFNα产生达到峰值；浓度过高时，Vidu摄取后引发显著的BDCA2内化，产生的抑制信号会阻断TLR9介导的IFNα反应。
讨论
这项研究扩展了我们对anti-Qβ包被的Vidu如何激活pDC的理解，并首次证明pDC特异性受体BDCA2在此过程中扮演了核心角色。与以往关注BDCA2抑制功能的研究不同，本研究发现，在特定条件下（即适度浓度的anti-Qβ包被），BDCA2对于Vidu携带的TLR9激动剂激活pDC至关重要。大多数PBMC亚群通过经典FcγR（CD16, CD32, CD64）摄取Vidu，而pDC则主要依赖BDCA2。阻断BDCA2会减少pDC对Vidu的内化、IFNα的产生以及分化。
BDCA2的这种双重作用可能解释了Vidu临床免疫反应和治疗反应的模式。临床上，患者在没有血清anti-Qβ抗体（即首次注射Vidu时）时未见免疫或临床反应。首次注射主要用于诱导anti-Qβ抗体产生。在第二次注射后（即体内已产生anti-Qβ抗体），患者和动物模型中才观察到免疫激活的迹象。接受多剂量Vidu治疗的患者会产生极高的anti-Qβ抗体水平，往往超过1.4 mg/ml。临床免疫激活的证据往往在2-3次注射后达到高峰，随后随着治疗的继续而减弱。超过最佳水平的anti-Qβ抗体可能导致免疫抵抗，甚至治疗抵抗，因为高浓度的anti-Qβ包被会诱导pDC中BDCA2的内化，并提供抑制信号，阻断IFNα的产生。
本研究结果提示，装载TLR9激动剂的纳米颗粒，若包被优化且受控浓度的BDCA2配体，或许能够在不依赖抗体调理的情况下激活pDC。与Vidu相比，这种设计可能具有三大优势：第一，靶向负责pDC摄取免疫刺激颗粒的受体（BDCA2），该受体不同于其他细胞摄取所用的受体（FcγR），可实现更特异性的pDC靶向。第二，BDCA2配体及其浓度可控，因此可以优化到既能激活pDC又不至于因过度交联而关闭pDC活性的“窗口期”。第三，此类颗粒可能在首次给药时就具有抗肿瘤活性，从而避免了需要先导剂量来产生anti-Qβ的步骤。目前，实验室正在评估多种表达半乳糖末端聚糖的分子作为BDCA2配体，用于靶向瘤内pDC的免疫刺激颗粒。
