《Frontiers in Plant Science》：Genetic mapping, marker development, and identification of candidate genes for powdery mildew resistance in Malus baccata ‘Jackii’
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本综述系统回顾了苹果抗白粉病研究进展，重点阐述了利用基因组学技术对野生资源Malus baccata ‘Jackii’的抗性基因Plbj进行遗传定位、开发紧密连锁的SSR及KASP分子标记，并将候选区域精细定位至单倍型1上约3.29-Mb区间的过程，为分子标记辅助育种和抗性基因的功能解析提供了重要基础。
引言
苹果是全球重要的温带水果作物，常遭受多种生物胁迫，其中由白粉菌属真菌引起的白粉病是苹果栽培中最具破坏性的真菌病害之一。其病原菌主要为Podosphaera leucotricha，这种专性活体寄生、子囊菌门的真菌，能够侵染超过10,000种植物，且具有高度的适应性和寄主跳跃能力。病害导致芽、枝、叶、花和果实延迟生长并畸形，每年造成巨大的经济损失并增加生产成本。目前的管理策略包括农艺措施以及化学和生物防治。然而，杀菌剂的长期使用存在抗性产生的风险，因此，种植抗病品种被视为防治白粉病最理想、最环保且经济可持续的策略。
苹果属中存在多种对白粉病的单基因或基因簇主效抗性，例如在Malus × robusta和Malus × zumi中发现的Pl-1和Pl-2，以及‘White Angel’中的P-lw。本研究的焦点材料Malus baccata‘Jackii’（简称Mbj）也携带一个名为Plbj的抗性位点，此前研究已将其定位在连锁群10上。为了将抗性基因更有效地应用于育种，本研究旨在利用Mbj的单倍型解析基因组序列，构建高分辨率的遗传连锁图，开发紧密连锁的分子标记，精确定位Plbj位点，并鉴定其中的候选抗性基因。
材料与方法
研究使用的植物材料包括感病品种‘Idared’和抗病基因型Mbj。两者杂交产生的F1群体（共122株，代号05225和06228）作为主要作图群体，种植于德国德累斯顿-皮尔尼茨的Julius Kühn-Institut实验田，无杀菌剂保护。此外，还包括来自相同杂交组合的127株次级F1群体（代号24230）以及45株由Mbj与上述F1个体回交产生的幼苗，均在温室条件下培育。
白粉病的表型鉴定基于田间自然感染。对主要作图群体在2009-2011年及2023-2024年进行了评估，采用了不同的病害分级标准。温室群体则根据症状有无直接分为抗病或感病。
基因型分析结合了多种技术。首先，对主要作图群体及其亲本进行了可调控的基因分型测序分析，产生了大量单核苷酸多态性标记。SNP的鉴定与基因分型采用了严格的参数，以确保准确性。同时，从文献和数据库（如HiDRAS网站）中筛选了分布于苹果所有17条染色体上的SSR标记，并针对抗性位点开发了新的SSR标记。DNA提取后，通过多重PCR和毛细管电泳进行SSR基因分型。
利用JoinMap 5软件，结合SNP和SSR数据，构建了Mbj单倍型1的遗传连锁图。随后，使用MapQTL 5软件，将基因型数据与多年表型数据相结合，进行数量性状基因座分析，通过Kruskal-Wallis检验和区间作图法定位与抗性相关的QTL。
为了将抗性作为质量性状定位，将2023-2024年的表型数据转换为抗/感二元数据，并将其作为一个标记整合到LG10的连锁图中进行计算。
通过两种方法将抗性连锁标记定位到Mbj的单倍型上：一是将新开发的SSR引物序列比对到两个单倍型的基因组上，比较预测与观测的PCR产物大小；二是分析nn×np型SNP标记在亲本及子代中的等位基因传递模式，并结合平均病害评分确定抗性关联的单倍型。
开发了两个位于Plbj附近的竞争性等位基因特异性PCR标记，用于验证和辅助选择。
最后，基于Mbj基因组的注释数据，在Plbj候选区域内，通过特定结构域和基因本体论术语，筛选出了最可能的抗病候选基因。
结果
F1群体的表型结果
田间主要作图群体的表型评估显示，白粉病感染的平均评分在年间有波动，但感染压力始终较高。综合所有年份，122株个体中有71株被归为抗病，51株至少一次被评定为感病。温室次级群体中，127株个体有46株抗病，81株感病。总计249株个体中，117株抗病，132株感病。
Mbj单倍型1的遗传连锁图
成功构建了覆盖17个连锁群的MbjHT1遗传连锁图，总长度为1071 cM。经过严格过滤和筛选，最终948个SNP标记和70个SSR标记被定位到连锁图上。标记在染色体上的分布基本与物理位置一致，但LG7的近端区域存在明显的重组匮乏区。
QTL分析揭示主效Plbj位点和一个新的微效位点**
Kruskal-Wallis分析和区间作图均证实，在2009-2011年及2023-2024年的所有表型时间点上，LG10和LG5上的标记均与白粉病抗性存在显著关联。LG10上的主效QTL（即Plbj）的LOD值介于16.34至35.73之间，最高可解释74%的表型变异，并始终超过全基因组显著性阈值。而LG5上的微效QTL的LOD值较低（2.49至4.63），仅在某些年份达到全基因组或染色体水平显著性，最高解释16.0%的表型变异。新开发的SSR标记LKSSRchr10_1478和LKSSRchr10_2718侧翼于LG10的QTL区域，而LKSSRchr10_1998和LKSSRchr10_2318B则与该QTL峰值高度连锁。LKSSRchr5_Mbj2与LG5上的微效QTL相关联。
Plbj定位于标记LKSSRchr10_1998与LKSSRchr10_2318B之间
通过分析不同群体中的重组个体，研究将Plbj定位在SSR标记LKSSRchr10_1998和LKSSRchr10_2318B之间的区间。将Plbj作为质量性状进行作图也将其位置确定在这两个标记之间。对26个在两个侧翼标记间发生重组的个体进行比较，发现同时携带这两个标记抗性等位基因的个体表现为抗病，而两个标记均不携带抗性等位基因的个体表现为感病。部分重组个体的表型进一步将Plbj局限于此区间内。
SNP与BLAST辅助的SSR分析确定抗性关联单倍型
分析证实，Plbj抗性与单倍型1相关联，而LG5上的微效QTL则位于单倍型2上。这一结果通过分析抗性连锁SNP标记的等位基因传递模式得到了进一步验证。
KASP标记的验证
新开发的两个KASP标记与SSR标记数据完全一致，未观察到明显的双重组事件。在包括‘Idared’在内的多个苹果栽培品种中检测，均只发现与感病相关的等位基因，而Mbj则携带抗性等位基因，验证了标记的特异性。
Plbj位点内的候选抗性基因
在单倍型1上，位于LKSSRchr10_1998和LKSSRchr10_2318B之间的3,287,286 bp候选区域内，共注释有209个基因。通过筛选含有NB-ARC、LRR、TIR等典型抗病蛋白结构域或与防御反应相关的基因，从中鉴定出了29个最可能的抗性候选基因。
讨论
白粉病对苹果产业的威胁日益严峻，减少农药使用的需求使得寄主抗性在可持续苹果生产中的地位愈发重要。将不同抗性基因聚合不仅能提高抗性的持久性，甚至可能产生超越单个最有效基因的抗病效果。因此，苹果育种的重要目标之一就是将高品质与针对同一或不同病原的多重抗性相结合。
本研究构建的MbjHT1遗传连锁图在长度和标记分布上与已发表的苹果遗传图相当，为后续的QTL定位提供了可靠框架。基于该图谱，本研究不仅确认了
