基于Far Western印迹技术定量分析细胞骨架蛋白互作：策略、方案与应用解析

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Quantifying cytoskeletal protein interactions with far Western blotting

这篇综述详细介绍了Far Western印迹(FWB)技术，一种用于检测和定量膜上蛋白互作(PPIs)的强大生化方法。文章系统阐述了FWB在解决细胞骨架蛋白（如角蛋白）研究局限性的应用方案，包括样品制备、电泳分离、膜转移、蛋白复性及检测等关键步骤。通过结合Western印迹(WB)作为上样对照，该方法增强了检测灵敏度，适用于分析低浓度样品。文中还以角蛋白32(KRT32)突变体与角蛋白82(KRT82)的亲和力比较为例，展示了FWB在量化相对结合强度和揭示疾病相关突变机制中的实用价值。

引言

蛋白-蛋白相互作用(PPIs)是理解细胞内蛋白功能的核心，涉及细胞组织、免疫应答、代谢与发育控制等多种生物过程，已成为系统生物学的基石。目前，PPIs的检测方法多样，包括活细胞中的酵母双杂交(Y2H)、荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、合成致死法及APEX邻近标记等，以及生化方法如串联亲和纯化、亲和层析、表面等离子共振(SPR)、蛋白微阵列、斑点印迹、共免疫沉淀(co-IP)、pull-down assay、蛋白片段互补、噬菌体展示、X射线晶体学和NMR光谱学等。

然而，细胞骨架蛋白的PPIs研究仍面临重大挑战。细胞骨架蛋白存在于所有三域生物中，参与细胞形态、分裂、运动、凋亡、分化和信号传导等功能。在人类中，许多疾病与细胞骨架蛋白异常相关，如心血管疾病、神经退行性疾病、癌症、肝硬化、肺纤维化和皮肤疾病等。研究细胞骨架PPIs的主要障碍在于这些蛋白的内在特性，如其倾向于形成高度稳定、不溶的结构，并易于与多种蛋白聚集，从而阻碍了直接结合伴侣的鉴定。

Western印迹(WB)自20世纪70年代发展以来，已成为生物学研究中定量目标蛋白最广泛使用的技术之一。Far Western印迹(FWB)则是80年代在WB基础上发展起来的，用于定量PPIs。FWB特别适用于研究结构蛋白，因为在这些蛋白中，邻近连接或其他细胞检测方法可能因单个蛋白被拴系在高度整合的细胞骨架蛋白质组中而无法提供信息。

FWB与WB均始于蛋白样品的上样和SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将样品转移至膜上（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜）。在WB中，一抗识别膜上的目标蛋白。而在FWB中，首先检测在SDS-PAGE分离过程中变性的膜结合“猎物”蛋白，然后对同一印迹膜进行处理，使附着蛋白复性。这一复性步骤确保蛋白恢复其天然构象，这对于“诱饵”-“猎物”蛋白的相互作用至关重要。复性后，将膜与“诱饵”蛋白孵育，随后用针对诱饵蛋白的抗体进行检测。应用二抗后，最终的FWB条带反映了诱饵蛋白与膜上猎物蛋白的结合。

重要的是，诱饵-猎物结合的强度会影响最终条带的强度。FWB的一个具体应用是确定目标蛋白（猎物）的突变如何影响其与结合伴侣（诱饵）的亲和力。在这种情况下，突变体和野生型蛋白在同一凝胶的不同泳道中运行。转移后，将膜与诱饵蛋白孵育，允许突变体和野生型猎物蛋白之间进行竞争性结合。突变体与野生型泳道中产生的条带强度反映了猎物-诱饵的相对结合亲和力。与上述其他PPI方法一样，FWB受猎物和诱饵蛋白之间相互作用强度的限制，通常需要中度到强相互作用。研究弱或瞬时的蛋白相互作用可能需要更灵敏的方法，如共聚焦扫描(PPI-CONA)、机械转导免疫吸附测定(METRIS)、荧光偏振(FP)或大规模平行测序(MP3-seq)。

本方案经过调整，可用于量化如细胞骨架蛋白等挑战性蛋白的相对结合强度。在同一张随后用于FWB的膜上整合WB，提高了检测的灵敏度，超越了传统膜染色的能力，从而将FWB的应用扩展到非商业化的蛋白。

材料与设备

试剂

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  纯化的猎物蛋白
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  纯化的诱饵蛋白
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  盐酸胍、氯化钠、Tris (1 M, pH 8.0)、EDTA (0.5 M, pH 8.0)
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  Immobilon?-P (PVDF)膜
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  一抗：c-Myc多克隆抗体、HA标签单克隆抗体
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  二抗：山羊抗兔IgG-HRP结合物、山羊抗小鼠IgG-HRP结合物
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  PageRuler? Plus预染蛋白Marker
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  Tris碱、甘氨酸、10% SDS、脱脂奶粉、Tween-20、DTT、甘油、TCEP溶液、甲醇、NuPAGE? LDS样品缓冲液(4×)、NuPAGE? MOPS SDS Running Buffer (20×)、SuperSignal? West Pico PLUS化学发光底物、Restore? Western印迹剥离缓冲液、Bis-Tris Mini蛋白凝胶(4%–12%)、Tris缓冲盐水(TBS, 10×)
  设备
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  iBright? CL1500成像系统、Mini Gel Tank、Trans-Blot? SD半干转印槽、ImageJ软件

方法

实验设计

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  蛋白纯化与样品制备：在研究细胞角蛋白时，使用纯化样品而非裂解液至关重要，以确保蛋白在实验开始前未结合。实验设计中一个重要考虑是，如果没有特异性抗体，应在质粒中包含标签。选择表位标签（如His、c-Myc或HA）是有益的，因为它们尺寸小（减少空间位阻）且有特异性抗体和抗体包被的磁珠可用。荧光标签（尤其是GFP）由于空间位阻或聚集，有破坏PPIs的较高风险。关键步骤是拥有足量的纯化蛋白。本FWB方案使用少至100 ng猎物蛋白和200 ng诱饵蛋白的纯化形式即可成功。实验开始前必须对样品进行定量，以确保所有孔上样均匀并确定标准化方法。蛋白定量的方法有多种，基于比色光谱的BCA测定法和荧光法NanoOrange?（用于更稀的样品）都是经过充分验证的选择。如果使用少于200 ng的猎物蛋白进行实验（低于使用Ponceau-S定量上样量的阈值），则有必要在膜转移后、与诱饵孵育前，对猎物蛋白进行检测（即必须先对猎物蛋白进行传统的WB）。用于猎物（WB中）和诱饵（FWB中）的一抗必须具有不同的宿主，以防止用于诱饵的二抗与用于猎物的一抗发生相互作用。可逆染色方案与WB的比较。如果可能，建议增加上样蛋白量，这样可以免除WB的要求。
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  标准对照：应包括阳性猎物对照（即已知的相互作用蛋白）。阴性对照（即已知的非相互作用蛋白），如BSA，也可以作为猎物蛋白加入。
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  猎物蛋白的变性/复性：SDS-PAGE在分离过程中使蛋白变性。在转印过程中，随着SDS被去除，蛋白通常会复性。由于FWB是一种PPI检测方法，在引入诱饵之前，确保猎物蛋白具有正确的三维构象至关重要。为确保转印的蛋白（最重要的是它们的结合位点）在转印过程中正确折叠，建议在盐酸胍中进行变性步骤，随后进行复性步骤，通过逐渐降低盐酸胍的浓度来实现。值得注意的是，虽然在小蛋白(<50个氨基酸)中不常见，但在一些大蛋白(>200个氨基酸)中已有蛋白错误折叠和聚集的报道。蛋白错误折叠可能消除天然结合结构域或引入新的结构域。这部分是由于环境因素（如pH、温度、盐和压力），以及聚集和折叠过程并行发生，其中更复杂的蛋白（慢速折叠）无法克服聚集速率，除非折叠在不同结构域中独立且同时发生。一些蛋白还需要特定的分子伴侣和辅助伴侣（在纯化蛋白样品中不存在）来通过结合和稳定折叠中间体促进正确折叠。配体与折叠中间体的结合也通过诱导构象变化和引导蛋白进入更有利的折叠途径来影响折叠的速率和效率。研究人员利用这一现象开发了药理性伴侣(PCs)，在体外和体内模型中均提高了折叠效率。为确定猎物蛋白在复性过程中是否发生错误折叠，建议使用已知的相互作用蛋白（阳性对照）和非相互作用蛋白（阴性对照）作为诱饵进行初步印迹实验，检测与非对照的非特异性结合或与阳性对照结合的缺失。在复性过程中表现出错误折叠的猎物蛋白不适合用于FWB。
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  检测：虽然荧光团偶联的二抗允许同时检测多个猎物蛋白，简化了实验，但基于化学发光的检测因其更高的灵敏度而更受青睐。这涉及将膜与底物孵育，该底物在与辣根过氧化物酶(HRP)（偶联在二抗上）反应时发光。发出的光在本方案中由iBright?检测。条带强度使用FIJI/ImageJ进行量化。
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  我们倾向于使用HRP偶联的二抗，因为它们更容易被剥离以便随后用其他抗体重新检测，并且比荧光标记具有更高的检测阈值。
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  FWB的灵敏度范围取决于具体环境，并受多种因素影响，包括蛋白丰度、膜选择和抗体亲和力。可以对这些参数进行滴定，作为初步步骤来确定所选蛋白和试剂组合的灵敏度范围。

实验步骤

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  样品制备与凝胶上样/电泳
  1. 1.
     上样缓冲液应新鲜配制。计算整个凝胶所需总量，并为整个实验准备储备液。
  2. 2.
     猎物蛋白必须用等体积的上样缓冲液稀释后再上样凝胶。
  3. 3.
     调整猎物蛋白浓度，使合适量的蛋白上样到凝胶上。每个孔应上样等体积的猎物蛋白。
  4. 4.
     将等体积的猎物蛋白和上样缓冲液在1.5 mL微量离心管中混合，在95°C热板上孵育5分钟。
  5. 5.
     上样分子量Marker。
  6. 6.
     凝胶在1× MOPS缓冲液中以80 V运行20分钟，然后根据猎物蛋白在凝胶上的位置（通过预染蛋白Marker监测）将电压增加到125 V运行一段时间。理想的情况是猎物蛋白保持在凝胶中部。
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  转印
  1. 7.
     将凝胶留在缓冲液中直至准备转印。
  2. 8.
     将PVDF膜在甲醇中孵育5秒以激活。
  3. 9.
     将激活的PVDF膜和转印垫转移到含有1×转印缓冲液的皿中。
  4. 10.
     使用转印垫、PVDF膜和凝胶创建转印“三明治”。
  5. 11.
     以13 V转印2小时。
• •
  Western印迹分析
  1. 12.
     将转印后的膜在5%脱脂奶粉的1× TBS-T中于室温摇动封闭1小时。
  2. 13.
     用针对猎物蛋白的一抗（在5%脱脂奶粉的TBS-T中稀释）于4°C摇动孵育过夜。
  3. 14.
     用TBS-T于室温摇动洗涤5分钟，重复三次。
  4. 15.
     用HRP偶联的二抗（在5%脱脂奶粉的TBS-T中稀释）于室温摇动孵育4小时。
  5. 16.
     用TBS-T于室温摇动洗涤5分钟，重复三次。
  6. 17.
     将膜在化学发光底物中于室温避光摇动孵育10分钟。
  7. 18.
     立即在iBright?上进行化学发光显影。
  8. 19.
     使用ImageJ的“analyze > gel > select lane”功能量化所有猎物条带。
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  膜剥离
  1. 20.
     猎物蛋白成像后，使用剥离缓冲液于室温摇动剥离二抗30分钟。
  2. 21.
     用TBS-T于室温摇动洗涤5分钟，重复三次以洗去剥离缓冲液。
  3. 22.
     将膜重新在化学发光底物中于室温避光摇动孵育10分钟。
  4. 23.
     通过在iBright?上进行5分钟曝光来验证二抗已完全剥离。
  5. 24.
     用TBS-T于室温摇动洗涤5分钟，重复三次以洗去化学发光底物。
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  膜上蛋白的变性/复性
  1. 25.
     通过在AC缓冲液中逐渐降低盐酸胍浓度，对膜上的蛋白进行变性和复性。
  2. 26.
     盐酸胍缓冲液每次必须新鲜配制，并应在转印过程中制备，以避免转印完成后膜变干。
  3. 27.
     缓冲液配方见表3。所有五种缓冲液溶液必须在4°C储存直至使用。所有孵育均在摇床上进行。在无盐酸胍的AC缓冲液中孵育膜需在4°C过夜进行。
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  封闭
  1. 28.
     变性和复性孵育完成后，将膜在5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中于室温摇动封闭1小时。
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  膜与纯化的相互作用（诱饵）蛋白孵育
  1. 29.
     在膜封闭期间，制备蛋白结合缓冲液。
  2. 30.
     将膜与纯化的诱饵蛋白（至少200 ng）在5 mL反应缓冲液中于室温摇动孵育3小时（或于4°C过夜）。
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  检测印迹上结合的诱饵蛋白
  1. 31.
     用TBS-T于室温摇动洗涤未结合的诱饵蛋白5分钟，重复三次（共四次洗涤）。
  2. 32.
     将印迹与一抗（在5%脱脂奶粉的TBS-T中稀释）于室温摇动孵育4小时。
  3. 33.
     用TBS-T于室温摇动洗涤5分钟，重复三次（共四次洗涤）。
  4. 34.
     接着与HRP偶联的二抗（在5%脱脂奶粉的TBS-T中稀释）于室温摇动孵育2小时。
  5. 35.
     用TBS-T于室温摇动洗涤5分钟，重复三次（共四次洗涤）。
  6. 36.
     将膜在化学发光底物中于室温避光摇动孵育10分钟。
  7. 37.
     立即在iBright?上显影以可视化诱饵蛋白的位置。
  8. 38.
     在ImageJ上量化诱饵条带强度。

结果

为展示Far Western印迹的应用，我们呈现了野生型(WT)角蛋白32 (KRT32^WT)与含有错义变异p.Thr99Ile的突变蛋白(KRT32^T99I)对角蛋白82 (KRT82)的结合亲和力比较结果。该p.Thr99Ile变异在一个患有松散生长期毛发综合征(LAHS)的大家系中被鉴定为可能的致病性杂合变异，并以常染色体显性方式与表型共分离。角蛋白32是一种在毛干角质层表达的I型毛发角蛋白，已知与II型毛发角蛋白82异源二聚化。

角蛋白是主要在上皮细胞中表达的细胞骨架蛋白，对机械稳定性、细胞完整性和细胞内信号传导至关重要。角蛋白基因的致病性变异与多种人类疾病有关，包括皮肤和肝脏疾病。人类有54种角蛋白，进一步分为I型和II型。角蛋白之间的高序列同源性阻碍了足以区分不同角蛋白的特异性抗体的开发。I型和II型角蛋白形成异源二聚体，是中间纤维(IFs)的前体。角蛋白具有极高的混杂性，I型蛋白能与任何II型蛋白结合，反之亦然。这些特性以及频繁的二硫键，常常导致I型和II型角蛋白从细胞裂解液中共同纯化。迄今为止，体外PPIs研究一直受到许多角蛋白特异性抗体不可用以及这些蛋白纯化困难的限制。

本研究使用KRT32^WT和KRT32^T99I作为猎物蛋白，KRT82作为诱饵蛋白。用c-Myc-KRT32^WT、c-Myc-KRT32^T99I或HA-KRT82^WT质粒转染HEK293细胞。使用抗c-Myc磁珠或抗HA磁珠分别从裂解液中纯化带有标签的KRT32和KRT82蛋白。纯化样品经过Western印迹以验证每个样品中目标蛋白的存在，并通过分子量确认。质粒设计中加入c-Myc和HA标签，使得在纯化步骤中可以使用预包被的磁珠，并使用高特异性的抗c-Myc和抗HA一抗。

显影的膜图像显示，通过抗c-Myc的WB揭示，c-Myc-KRT32猎物蛋白（~60 kDa）上样量相似。随后，抗c-Myc的二抗被完全剥离。接着，将膜与纯化的HA-KRT82孵育，并应用抗HA一抗。在应用抗HA的二抗后，得到的FWB膜在~60 kDa处显示条带，反映了KRT32与KRT82之间的结合。KRT32^T99I的该条带明显弱于KRT32^WT，揭示角蛋白32第99位氨基酸的苏氨酸到异亮氨酸的替换降低了其与角蛋白82的结合亲和力。该实验进行了四次生物学重复，显示c-Myc-KRT32^T99I的条带强度比c-Myc-KRT32^WT条带降低了20.7%。使用ImageJ的“analyze > gels > plot lanes”功能对条带进行量化，该功能允许选择条带和量化信号。将诱饵检测的条带归一化到其各自猎物检测的条带，并比较KRT32^WT和KRT32^T99I泳道。

在方案调整过程中遇到了一些障碍。大多数问题发生在实验的初始步骤（蛋白纯化到膜剥离）。表6包含了一些最常见的问题、可能的原因和解决方案。

讨论

尽管各种技术推动了PPI研究的发展，但细胞骨架蛋白由于其倾向于形成大、稳定且不溶的聚集体，对许多PPI研究方法的使用构成了独特的挑战。本研究强调了FWB作为研究涉及细胞骨架蛋白的PPIs的有效工具的潜力。FWB特别适用于研究使用其他方法难以分析的结构蛋白，它提供了一种基于分子量检测结合伴侣的简化方法。当细胞环境或固定的细胞内定位限制了其他技术时，这一点尤其有价值。

此外，FWB可用于研究基因变异对蛋白相互作用的影响，为了解由细胞骨架蛋白相互作用破坏引起的疾病提供见解。通过比较野生型和变异蛋白，如角蛋白案例研究所示，FWB帮助研究人员理解蛋白结构的细微变化如何导致疾病表型。

总之，FWB为具有标准生化能力的实验室提供了一种强大且广泛适用的PPI分析方法。除了对细胞骨架蛋白的实用性外，它还广泛适用于结构蛋白或不溶性蛋白，以及缺乏特异性抗体的蛋白。因此，FWB代表了任何研究蛋白生物学的实验室生化研究工具箱中的宝贵补充。