《Frontiers in Immunology》：Construction of circadian clock signature for tumor microenvironment in predicting survival of esophageal squamous cell carcinoma
编辑推荐：
本研究通过生物信息学分析，在食管鳞状细胞癌（ESCC）中构建了包含七个差异表达昼夜节律钟基因（CST3, C1QBP, TTF2, EGFR, CDKN2A, PFAS, TRRAP）的预后风险模型，揭示了其与不良预后及免疫浸润增强相关。其中，CST3 与 PD-L1 的联合表达是评估 ESCC 患者预后的潜在标志物，且 CST3 可作为独立的预后生物标志物和治疗靶点，为 ESCC 的精准治疗提供了新思路。
引言
食管癌（EC）是全球第八大常见恶性肿瘤和癌症相关死亡的第六大主要原因，其中食管鳞状细胞癌（ESCC）是主要亚型，约占所有 EC 病例的84%。尽管靶向治疗和免疫疗法部分弥补了 EC 治疗的不足，但其临床结果仍不理想。昼夜节律钟基因（CCGs）根据昼夜循环呈现节律性表达，调控多种生理过程。越来越多的研究表明，生物钟通过复杂机制在癌症发展和进展中至关重要，CCGs 可能成为癌症诊断和治疗的新靶点。肿瘤微环境（TME）是肿瘤进展和治疗抵抗的关键调节因子。有证据表明，时钟基因协调调控多种 TME 重塑过程。然而，目前关于 CCGs 在 ESCC 的 TME 中的作用尚未得到全面研究。因此，本研究旨在通过生物信息学技术识别 ESCC 的差异表达 CCGs（DE-CCGs），并构建风险模型以评估其特征基因的预后意义及与 TME 的相关性，进一步研究 CST3 与免疫浸润和肿瘤进展的关系。
材料与方法
本研究从 TCGA 数据库获取了 TCGA-ESCC 的表达数据和临床特征，从 GEO 数据库获取了 GSE23400 和 GSE53625 数据集，并从 Gene Cards 数据库下载了 3028 个 CCGs。通过 DESeq2 和 limma 包进行差异表达基因（DEG）分析。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与癌症发生高度相关的基因模块。将 DEGs 与 CCGs 取交集得到 DE-CCGs。通过单变量 Cox 回归和 LASSO 回归分析确定与预后相关的 DE-CCGs 以构建风险模型。通过 Kaplan–Meier 分析和生存曲线验证模型的准确性。通过基因集富集分析（GSEA）进行生物学功能富集。使用多种算法（如 CIBERSORT、ESTIMATE、xCell 等）进行免疫浸润分析。从 CellMiner 数据库获取药物敏感性数据，分析 CST3 表达与药物敏感性的相关性。此外，研究收集了 102 名 ESCC 患者的肿瘤组织和癌旁正常组织，通过免疫组化（IHC）评估 CST3 和 PD-L1 表达，并通过细胞增殖实验验证 CST3 的功能。
结果
1. 识别 ESCC 与正常样本之间的高相关基因模块
与正常样本相比，在 TCGA-ESCC 中鉴定出 2491 个上调和 2686 个下调的 DEGs，在 GSE23400 中鉴定出 243 个上调和 203 个下调的 DEGs。通过 WGCNA 分析，在 TCGA-ESCC 和 GSE23400 队列中分别发现了 11 个和 8 个基因模块，其中青绿色模块和蓝色模块与肿瘤发生密切相关。最终提取出 339 个候选核心基因。
2. 构建 ESCC 中与 CCGs 相关的预后风险模型
将来自 Gene Cards 数据库的 3028 个 CCGs 与 TCGA-ESCC 和 GSE23400 中的高相关 DEGs 取交集，筛选出 216 个目标基因。单变量 Cox 分析识别出 30 个与预后相关的基因。LASSO 算法最终确定了七个候选核心基因（CST3, C1QBP, TTF2, EGFR, CDKN2A, PFAS, TRRAP）来建立预后特征。风险评分计算公式为：风险评分 = (CST3 表达量 * 0.54179124) + (C1QBP 表达量 * -0.298329668) + (TTF2 表达量 * -0.121834423) + (EGFR 表达量 * -0.068621876) + (CDKN2A 表达量 * -0.262690427) + (PFAS 表达量 * -0.143824307) + (TRRAP 表达量 * -0.357097173)。根据中位风险评分将患者分为高风险（HR）组和低风险（LR）组。结果显示，除 CST3 显著上调外，其他预后基因在 HR 组中均显著下调。Kaplan–Meier 分析表明，HR 组患者的生存概率显著低于 LR 组。这七个基因构成了一个与 CCGs 相关的预后风险模型，其中 CST3 是唯一在 ESCC 中显著过表达的致癌基因，而其他基因则作为抑癌基因低表达。
3. CCG 相关预后特征的性能
热图展示了七个 DE-CCGs 的表达水平。小提琴图显示风险评分与 T 分期显著相关。结合年龄、性别、分期和风险评分构建了预测总生存期（OS）的列线图，其中风险评分对预测性能影响最大。该模型预测 1 年、2 年和 3 年 OS 的受试者工作特征曲线下面积（AUCs）分别为 0.68、0.81 和 0.77，验证了其强大的预测能力。
4. HR 组的 GSEA 分析
GSEA 分析表明，在基因本体（GO）术语中，HR 组的基因显著富集于与免疫相关的生物系统，例如炎症反应的正调控和适应性免疫反应的调控。而下调的通路包括免疫效应过程、白细胞趋化性和髓系白细胞迁移。这些结果可能揭示了 HR 组基因在免疫状态中的机制。
5. 风险模型与肿瘤浸润免疫细胞（TIICs）的关联
免疫细胞浸润与癌症患者的预后相关。xCell 算法显示，HR 组的免疫细胞（如 CD4+T 细胞、CD4+Tcm、CD4+Tem、CD8+T 细胞、CD8+Tcm、巨噬细胞和 M1 巨噬细胞）浓度更高。ESTIMATE 算法显示 HR 组的免疫评分升高。ssGSEA 算法揭示了 HR 组与 ESCC 中肿瘤浸润水平增加显著相关。值得注意的是，预后基因 CST3 与大多数免疫细胞呈高度正相关。进一步分析发现，HR 组表现出 TIGIT、CD244 和 IL10RA 等基因的表达升高，这可能通过共同调节免疫检查点信号和效应淋巴细胞功能来协同重塑肿瘤免疫微环境。
6. CST3 的肿瘤免疫浸润分析和药物敏感性分析
TIMER2.0 分析显示，CST3 表达与 B 细胞、CD4+T 细胞、中性粒细胞和巨噬细胞呈正相关，但与肿瘤纯度呈负相关。ESTIMATE 算法表明 CST3 表达与基质评分和免疫评分呈正相关，这暗示了 TME 复杂性的增加。CIBERSORT 分析表明，CST3 表达与 CD8+T 细胞、静息记忆 CD4+T 细胞、调节性 T 细胞和 M2 巨噬细胞呈正相关。药物敏感性分析显示，CST3 表达与多种 PI3K/mTOR 抑制剂（如 GSK-2126458、Apitolisib、Pictilisib 和 CH-5132799）和 MEK 抑制剂（如 Pimasertib 和 ARRY-162）的敏感性呈正相关，为联合用药提供了线索。
7. CST3 和 PD-L1 表达与 ESCC 患者预后的关联
免疫组化分析显示，CST3 和 PD-L1 在癌组织中的表达均显著高于癌旁正常组织，且两者表达呈正相关。生存分析表明，CST3 和 PD-L1 均高表达的患者，其总生存期（OS）短于仅单一蛋白高表达的患者。这表明 CST3 和 PD-L1 的联合表达模式可作为 ESCC 的一个强有力的预后生物标志物。
8. CST3 和 PD-L1 在体外协同促进 ESCC 细胞生长
成功建立了 CST3 敲低的 EC109 和 KYSE140 细胞系。细胞增殖和集落形成实验表明，敲低 CST3 可显著抑制 ESCC 细胞的体外增殖。同时，使用 PD-L1 中和抗体阻断内源性 PD-L1 活性后，发现同时抑制 CST3 和 PD-L1 对 ESCC 细胞增殖产生了协同抑制作用。这些结果表明，CST3 在 ESCC 中发挥促肿瘤作用，支持其作为 ESCC 治疗靶点的潜力，并且共同靶向 CST3 和 PD-L1 可能代表一种新的 ESCC 治疗策略。
讨论
由于缺乏基于特定驱动基因的靶向疗法，ESCC 患者的预后较差。越来越多的证据表明，昼夜节律机制显著影响肿瘤发生。本研究通过 WGCNA 和机器学习综合分析，鉴别出七个与 ESCC 密切相关的 CCGs，并基于这些基因构建了预后风险模型。其中，CST3 与 ESCC 患者的不良预后相关。高风险患者表现出肿瘤浸润免疫细胞水平显著升高，并伴随 T 细胞耗竭标志物（如 TIGIT）的表达。先前的研究已描述了这些模型基因的生物学作用和功能。例如，CST3 通过调节肿瘤免疫微环境来促进肿瘤进展。靶向 PD-1/PD-L1 的免疫抑制剂是 EC 治疗的主要药物，但其诊断效果仍不确定。值得注意的是，CST3 最近被报道与免疫检查点阻断的应答缺乏有关。本研究首次在 ESCC 中检验了 CST3 与 PD-L1 之间的关联。研究结果显示，CST3 和 PD-L1 在癌组织中表达更高，且与不良的临床病理特征呈正相关。CST3 和 PD-L1 均高表达的患者 OS 更短。体外实验证实，敲低 CST3 可显著抑制 ESCC 细胞增殖，而 PD-L1 阻断可进一步增强这种抑制。这些发现表明，CST3 可能通过与 PD-L1 的协同相互作用重塑肿瘤免疫微环境，从而驱动 ESCC 进展。未来需要在更大样本量的多中心临床队列中验证 CST3 和 PD-L1 作为潜在生物标志物组合的预后和治疗价值。
结论
肿瘤微环境极其复杂，导致只有有限比例的 ESCC 患者能从 PD-1/PD-L1 靶向治疗中获益。因此，ESCC 的管理和精准治疗需要多样化的基因靶点、靶向疗法和新的免疫受体。尽管在免疫学和癌症生物学中对 CCGs 进行了广泛研究，但这些基因在肿瘤免疫领域仍未得到充分探索。本研究探讨了 CCGs 在 ESCC 发展中的作用，并阐明了它们与患者预后和免疫反应的相关性。研究结果特别指出，CST3 和 PD-L1 在 ESCC 中具有协同效应，共同靶向 CST3 和 PD-L1 可能代表一种新的 ESCC 治疗策略。这些新见解增强了我们对 TME 的理解，并可能揭示新的免疫和治疗靶点。
