《BMC Zoology》：Reproductive pattern and biochemical composition of the sea urchin, Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816) in west Aegean Sea-Türkiye
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本文系统研究了土耳其西爱琴海卡巴伦地区的紫色球海胆（Paracentrotus lividus）的年繁殖周期与生化组成。研究发现，该种群存在春秋两次产卵高峰期，且雌性性腺指数（GSI）高于雄性。研究揭示了性腺指数（GSI）与温度、光周期无显著相关性，而肠道指数（GI）在性腺指数降低时保持相对稳定，表明在繁殖与生存之间存在能量分配的权衡。生化分析显示，蛋白质在春季主要产卵期前含量升高，而糖原和脂质在全年的其他产卵活动前被利用。该研究为理解该关键水产物种的繁殖生理和营养动态提供了重要数据，对实现其有效繁殖管理和可持续水产养殖（Aquaculture）具有指导意义。
引言
紫色球海胆（Paracentrotus lividus）是地中海和东北大西洋海岸广泛分布、具有重要经济价值的海胆物种。由于全球范围内的过度捕捞导致其野生种群数量下降，同时市场需求持续强劲，海胆养殖业受到了越来越多的关注。繁殖生物学在养殖中占有重要地位，了解其年繁殖周期和营养动态对于有效的繁殖管理至关重要。性腺状况（gonad condition）分析（包括性腺指数评估和组织学检查）是揭示其繁殖策略的关键手段。已有研究表明，不同地理种群的海胆其产卵期存在差异，有的地区为单次产卵，有的则为双次产卵。影响海胆性腺指数（GSI）的因素多样，包括食物可得性、环境条件（如温度、光周期、水动力）以及繁殖周期本身。在土耳其，尽管紫色球海胆在藻类和沙质潮下带栖息地中大量存在，但与地中海北部和大西洋地区相比，针对爱琴海区域该物种的研究仍较为匮乏。本研究旨在通过对爱琴海西岸（土耳其伊兹密尔卡巴伦地区）紫色球海胆的性腺指数、组织学检查和生化分析，评估其繁殖状况。
材料与方法
研究地点、环境参数与取样方法
研究于2018年7月至2019年6月期间，每月在土耳其伊兹密尔卡巴伦（38°38’56.89” N, 26°30’49.51” E）海域采集60只紫色球海胆个体。采样区域为石质、藻类和海草（主要为大洋海神草 Posidonia oceanica 和孔雀藻 Padina pavonica）丰富的区域，距海岸约200-300米，水深约10米。样本主要通过水肺潜水随机采集，个体测试直径（test diameter）大多在40-60毫米之间。现场测量了水温（水银温度计）和盐度（手持折射仪），光周期数据由土耳其气象局（MGM）提供。活体样本被运送至爱琴大学乌拉研究实验室，并立即解剖以防止自发性配子释放影响后续分析。
形态测量
使用游标卡尺测量海胆的水平测试直径（带刺和不带刺）和高度（口-反口轴方向，带刺高度和测试高度），并使用电子天平（精度0.001克）称重。随后，所有海胆均通过围口膜解剖以取出内部器官。
组织学
性腺组织学切片的制备参考了Quchene等人（2021）的方法。新鲜解剖出的性腺保存在戴维森氏固定液中，随后经梯度酒精脱水、石蜡包埋，并用切片机切成7微米厚的切片。切片经苏木精-伊红（H&E）染色后，在光学显微镜下观察并拍照，以确定性腺发育阶段。根据早期研究者的描述，将性腺发育分为6个阶段（静止期、退化期、生长期、成熟期、排放期、排放后期）。通过组织学检查确定性別，并计算种群性别比、雌性比（FSR）和雄性比（MSR）。
生化分析
生化分析基于干物质进行。性腺样品经冷冻干燥后研磨成粉。蛋白质含量采用Lowry法测定，使用牛血清白蛋白V作为标准。糖原和总糖含量采用苯酚-硫酸法测定。脂质含量采用改良的Bligh和Dyer法提取测定。所有测量均使用酶标仪进行，并设置三次重复。
身体组分指数
分别称量性腺、肠道、外壳（test）、亚里士多德提灯（Aristotle‘s lantern）和围脏液（perivisceral liquid）的湿重。计算各组分指数，即各组分湿重占海胆总湿重的百分比：
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性腺指数（GSI）(%) = (性腺湿重 / 海胆总湿重) x 100
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肠道指数（GI）(%) = (肠道湿重 / 海胆总湿重) x 100
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外壳指数（TI）(%) = (外壳湿重 / 海胆总湿重) x 100
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提灯指数（AI）(%) = (亚里士多德提灯湿重 / 海胆总湿重) x 100
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围脏液指数（PI）(%) = (围脏液湿重 / 海胆总湿重) x 100
统计分析
使用Microsoft Excel处理生物测量和生理指数数据，使用SPSS 22.0进行统计分析。所有检验的显著性水平设为p < 0.05。采用Levene检验和ANOVA（方差分析）或Kruskal-Wallis检验分析性别和月份对形态测量及指数值的影响差异。采用t检验分析性别对各身体指数的影响。采用ANOVA和Tukey检验分析不同月份间指数的差异。采用Pearson检验分析水温、光周期与各身体指数及生化成分之间的相关性。采用卡方检验分析各月份间性别比的差异。
结果
生物测量与性别比
雌性个体的测试直径在44.42 ± 7.07毫米（6月）到56.39 ± 2.68毫米（4月）之间变化，总重在50.48 ± 11.51克（11月）到77.15 ± 16.82克（2月）之间。雄性个体的测试直径在51.49 ± 9.80毫米（9月）到59.76 ± 2.69毫米（4月）之间变化，总重在51.11 ± 9.33克（11月）到81.40 ± 9.19克（4月）之间。统计显示，性别间在直径、高度和重量上无显著差异（p > 0.05），但不同月份间存在显著差异（ANOVA, p < 0.05）。雌雄比例为2:1，8月份未观察到雄性个体。雌性在秋季和冬季占比较高，而雄性在春季和初夏占比更高，月份间的性别分布存在统计学差异（p < 0.05）。
性腺指数与环境因子
全年雌性性腺指数（GSI）均高于雄性。两性的GSI从7月开始上升，随后下降，从2月起再次上升。最冷月（2月）水温为14.2°C，最暖月（6月）为25.4°C。最短光周期出现在12月（9.5小时），最长在6月（14.8小时）。尽管从图表上看，GSI在温度下降的月份出现峰值且与光周期变化似乎存在关联，但统计分析未发现性腺指数与温度或光周期之间存在显著相关性（r = -0.123 至 0.177, p > 0.05）。
性腺发育阶段
性腺发育阶段被分为六个时期：
- 1.
静止期：特征为卵泡（f）小而形态不定，缺乏卵母细胞（o）或精母细胞（sg），内含营养细胞网状结构（nc）。
- 2.
退化期：卵泡内结构难以分辨，由残余细胞或空细胞构成，表明退化阶段。
- 3.
生长期：初级卵母细胞（po）稀疏地出现在卵泡壁，标志着卵黄发生的开始。沿卵泡壁排列的生殖细胞（精原细胞、卵原细胞）被营养吞噬细胞（np）包围。
- 4.
成熟期：卵巢和睾丸中配子发生显著发展。卵黄生成卵母细胞（v）增大并向卵泡腔中心迁移，同时营养吞噬细胞减少。随着营养吞噬细胞的减少，卵母细胞覆盖卵泡内部。这些细胞分化为精子（sz），以波浪状聚集在卵泡腔中心。精母细胞层也可见于卵泡壁。
- 5.
排放期：排卵开始导致卵泡腔内形成空腔。睾丸密度降低。可在卵泡外观察到卵母细胞和精子。卵子发生持续，初级卵母细胞取代成熟的卵母细胞。
- 6.
排放后期：随着排卵增加，睾丸和卵巢中出现更多空腔。仅可见少数未排出的卵子或精子簇。营养吞噬细胞开始重新填充空间。
研究发现，雌性性腺几乎全年都在发育，而产卵主要发生在2月至6月间。雄性性腺发育在9-10月和1-3月较为明显。雌性的成熟性腺在10-11月和2-3月最为普遍，这与观察到的产卵活动期相符。
生化成分
性腺生化成分分析显示，蛋白质含量在47.63 ± 0.20%至64.26 ± 0.97%之间波动，在11月和12月达到峰值。糖原含量在12月（1.42 ± 0.08%）、1月（1.09 ± 0.02%）和5月（1.11 ± 0.03%）最高。脂质含量在8月（16.88 ± 0.28%）和12月（16.02 ± 0.54%）达到峰值。碳水化合物含量在1.22 ± 0.17%至3.83 ± 0.14%之间。生化成分与性腺指数（GSI）无显著相关性（p > 0.05）。在生化成分与水环境参数的关系中，仅发现蛋白质含量与光周期呈负相关（r = -0.762， p ≤ 0.04），与其他参数无显著相关。除糖类和糖原之间呈强相关外（r = 0.862， p ≤ 0.000），其他化合物间的相关性不显著。
身体组分指数
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性腺指数：雌性GSI在7月和9月达到峰值，雄性则在7月（4.02 ± 0.57%）和3月（3.96 ± 1.59%）最高。
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肠道指数：雌雄个体的GI在2月至4月间达到最大，峰值出现在3月（11.82 ± 2.54%）。雄性GI范围在5.73 ± 1.38%至10.56 ± 2.08%之间。
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外壳指数：雌雄个体的TI在43.68 ± 2.61%至55.09 ± 4.44%之间变化。
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提灯指数：AI在3.51 ± 0.33%至4.81 ± 0.52%之间。
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围脏液指数：PI最大值出现在5月（30.71 ± 3.83%），最小值在6月（20.13 ± 4.13%）。
统计显示，性别对性腺指数（GSI）和围脏液指数（PI）有显著影响（p < 0.05），而对肠道指数（GI）、提灯指数（AI）和外壳指数（TI）无显著影响。ANOVA检验表明，雌性GSI在7月与其他月份有显著差异，雌性GI在3月和10月与其他月份有显著差异。雄性GSI在2月和3月与其他月份有显著差异，雄性GI在5月与其他月份有显著差异。
讨论
环境因素如温度、水动力条件、食物可得性和光周期对海胆性腺状况有重要影响。本研究发现，雌性性腺几乎全年生长，而雄性性腺则在温度较低的秋季和春季生长，这与一些研究认为降温促进性腺生长的观点一致。然而，也有研究认为温度和光照对性腺发育影响不大。本研究记录的性腺指数（GSI）值（雌性最高5.01%，雄性最高4.02%）低于大西洋沿岸等许多其他地区报告的数值（可达18%），这可能与研究区域缺乏大型藻类等丰富食物来源有关。研究证实了该地中海种群存在春秋双次产卵模式，主要产卵期在2-3月，次要产卵期在10-11月，这与地中海其他地区（如法国科西嘉岛、意大利、阿尔及利亚）的观察结果一致。产卵时间可能受温度、食物可得性以及光周期和水中配子存在等特定环境信号的触发。
研究发现，尽管种群密度较低，但性腺指数并未异常高，暗示除了密度外，其他非生物因素可能在本研究中对性腺发育起主导作用。本研究记录的外壳指数（TI）相对较高，可能与食物可得性及水动力条件相关，已有研究表明在营养丰富的环境中，外壳重量会增加。肠道指数（GI）存在季节性波动，并在性腺指数下降时保持相对稳定甚至升高，这反映了生物体在繁殖期结束后将能量重新分配到摄食和维持生存的生理策略。亚里士多德提灯指数（AI）的观测值（约3.8%）与同地区法国研究结果相近，但与邻近站点因底质不同而有所差异，支持了食物可得性和水动力条件影响提灯发育的观点。围脏液指数（PI）表现出季节性变化，冬季升高而夏季降低，这与前人关于其全年稳定的报道有所不同。
生化分析表明，蛋白质、糖原和脂质的含量呈现季节性波动，并与繁殖周期相关。蛋白质含量在春季主要产卵期前升高，可能为配子发生和性腺形成提供结构和功能支持。糖原和脂质作为配子发生和性腺形成的主要能量来源，在其他产卵活动前被利用。这些发现揭示了紫色球海胆在年繁殖周期中能量储存和利用的动态模式。
综上所述，本研究详细描述了土耳其西爱琴海卡巴伦地区紫色球海胆的繁殖生物学和生化特征，揭示了其双峰产卵模式、身体组分指数的季节性变化以及能量物质的动态分配。这些结果加深了对该物种在特定环境条件下繁殖策略的理解，为未来制定针对该地区海胆种群的可持续管理和水产养殖策略提供了重要的科学依据。
