Rho相关卷曲螺旋激酶1（ROCK1）和ROCK2在TGF-β-SMAD信号通路中的相反作用

本研究揭示ROCK1与ROCK2在TGF-β-SMAD信号通路中具有相反的 kinase 依赖性作用，通过影响SMAD3磷酸化及核转位调控乳腺癌细胞增殖与转移行为。

　　

摘要

背景

转化生长因子-β（TGF-β）通过I型和II型激酶相关的跨膜受体传递信号，激活依赖SMAD和独立于SMAD的通路，包括Rho/ROCK轴及其效应因子ROCK1和ROCK2。然而，ROCK亚型在乳腺癌细胞中的TGF-β-SMAD信号传导中的作用尚未明确。

方法

使用CAGA₁₂-萤光素酶报告基因测定法来检测依赖SMAD3/4的转录活性。通过小分子激酶抑制剂和RNA干扰介导的基因沉默进行功能丧失分析。通过免疫印迹、免疫荧光染色、亚细胞分级、体外激酶活性测定和mRNA表达测定来获取机制证据。质谱分析结合共免疫沉淀实验研究了ROCK亚型与其他TGF-β信号通路成员之间的相互作用。

结果

ROCK2的敲低或使用选择性ROCK2激酶抑制剂KD025处理可抑制TGF-β-SMAD信号传导，而ROCK1的敲低则产生相反的效果。过表达研究表明，ROCK1抑制TGF-β诱导的依赖SMAD3/4的转录活性，而ROCK2则增强这种活性。这些效应可以通过表达失活激酶的ROCK1（K105R）或ROCK2（K121D）突变体以及使用ROCK抑制剂来逆转，这表明这两种亚型的激酶活性对于它们的相反功能是必需的。我们还发现ROCK1和ROCK2在细胞内的定位不同，且SMAD3仅与ROCK1相互作用，而不与ROCK2相互作用。ROCK2的抑制降低了SMAD3 C末端（Ser423/425）和连接区（Ser204和Ser208）的丝氨酸残基的磷酸化程度，减少了SMAD3和SMAD4在核内的积累，并抑制了TGF-β-SMAD靶基因的表达。功能上，ROCK1的缺失促进了MDA-MB-231细胞的增殖和侵袭，而ROCK2的缺失则减少了细胞的增殖和侵袭。

结论

ROCK1和ROCK2对TGF-β-SMAD信号传导具有相反的、依赖激酶的作用，并对乳腺癌细胞的行为产生不同的影响。