外周血IFN-γ+毒性淋巴细胞可作为肝细胞癌PD-1/PD-L1治疗反应的预测性生物标志物

《Frontiers in Immunology》：Association between peripheral IFN-γ+ cytotoxic lymphocytes and response to PD-1/PD-L1-based therapy in hepatocellular carcinoma

这项研究探讨了肝细胞癌（HCC）患者接受PD-1/PD-L1疗法（ICT）联合或不联合酪氨酸激酶抑制剂（TKI）或贝伐珠单抗（Beva）治疗时，外周血中不同细胞毒性淋巴细胞（CTL、NK、NKT细胞）亚群比例及其功能（IFN-γ+、GZMB+）与治疗反应的关系。研究发现，与ICT单药相比，ICT+TKI联合治疗能提高应答率（ORR），并伴随IFN-γ+毒性淋巴细胞比例升高。在所有治疗方案中，外周血IFN-γ+的CTL、NK、NKT细胞频率与治疗应答显著相关，并表现出良好的鉴别能力，而血清IFN-γ水平则无预测价值。该研究支持外周血IFN-γ+毒性淋巴细胞作为一种无创的候选生物标志物，用于预测HCC患者对PD-1/PD-L1疗法的反应。

　　

1 引言

肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因。大多数患者在确诊时已处于晚期，失去了手术机会，因此全身性治疗在HCC临床管理中起着关键作用。以程序性死亡受体-1（PD-1）或其配体PD-L1为靶点的免疫检查点抑制剂（ICIs）通过恢复T细胞介导的抗肿瘤免疫，重塑了HCC的治疗格局。然而，其临床获益有限，客观缓解率（ORR）仅约15%。为了改善疗效，将ICIs与酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）或抗血管内皮生长因子（VEGF）药物联合的策略已被开发。尽管联合疗法已成为晚期HCC一线治疗的关键组成部分，但对基于PD-1的免疫治疗的反应仍然存在高度异质性。因此，迫切需要识别能够指导治疗选择和评估疗效的生物标志物。细胞毒性T细胞（CTLs）、自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞是关键的抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞亚群。与组织取样相比，外周血作为一种更易获取的动态监测来源，可能提供有价值的免疫相关信息。本研究旨在全面评估接受基于PD-1/PD-L1治疗的HCC患者外周血CTL、NK和NKT细胞的比例和功能状态，以识别潜在的外周免疫相关指标。

2 材料和方法

2024年8月至2025年7月期间，共纳入55例在安徽医科大学第二附属医院接受基于PD-1/PD-L1免疫治疗（包括单药、联合TKI或VEGF抑制剂）的HCC患者。疗效评估采用改良实体瘤疗效评价标准（mRECIST）。ORR定义为完全缓解（CR）加部分缓解（PR）。收集回顾性临床信息。使用流式细胞术分析外周血细胞毒性淋巴细胞亚群及其效应功能。血清α-甲胎蛋白（AFP）和异常凝血酶原（PIVKA-II）水平通过免疫分析法测定。循环血清IFN-γ水平通过多重细胞因子检测试剂盒测定。统计分析包括组间比较、受试者工作特征（ROC）曲线分析、多变量逻辑回归和相关性分析。

3 结果

3.1 各治疗组间的临床和实验室特征

在接受PD-1/PD-L1单药（ICT）、ICT联合TKI（ICT+TKI）或ICT联合贝伐珠单抗（ICT+Beva）治疗的患者中，年龄、性别、病因、BCLC分期、肝功能、复发情况及外周免疫细胞计数等方面均无显著统计学差异。血清AFP和PIVKA-II水平在各组间也具有可比性。

3.2 ICT单药与ICT+TKI/ICT+Beva治疗组间外周CTL、NK、NKT细胞比例和功能的比较

疗效评估显示，ICT+TKI组比ICT单药组和ICT+Beva组获得了更高的ORR（54.5% vs. 29.4% 和 37.5%）。流式细胞分析表明，与ICT单药相比，ICT+TKI治疗增加了外周血CD8⁺T细胞的比例。功能分析显示，仅有NKT细胞（CD3⁺CD16/CD56⁺）的GZMB⁺细胞百分比更高。相比之下，ICT+TKI组在所有细胞毒性淋巴细胞亚群（包括CTL、NK和NKT细胞）中IFN-γ⁺细胞百分比均显著升高。在ICT单药和ICT+Beva组之间，细胞毒性淋巴细胞的比例和功能状态均未观察到差异，这与它们相当的ORR结果一致。

3.3 应答者与非应答者外周CTL、NK、NKT细胞比例和功能的比较

根据ORR将患者分为应答者与非应答者。这些细胞亚群的比例在两组间无显著差异。功能状态评估显示，仅在NK细胞中，应答者的GZMB⁺细胞百分比显著高于非应答者。相反，应答者在所有细胞毒性淋巴细胞亚群（包括CD8⁺T细胞、NK细胞和NKT细胞）中，IFN-γ⁺细胞百分比均显著更高。与临床特征的比较显示，应答者的血清AFP和PIVKA-II水平显著低于非应答者。年龄、性别、病因、BCLC分期等因素在两组间无显著差异。

3.4 IFN-γ阳性细胞毒性淋巴细胞亚群与治疗反应及肿瘤标志物下降相关

为评估外周细胞毒性淋巴细胞测量对治疗反应的鉴别性能，进行了ROC分析。在单参数ROC曲线中，IFN-γ⁺亚群显示出最有利的曲线模式。临床模型（包含log10转化后的AFP、BCLC分期、肝功能Child-Pugh分级及治疗方案）的ROC曲线下面积（AUC）为0.626。将IFN-γ⁺CTL、NK或NKT的频率加入临床模型后，AUC分别提升至0.829、0.769和0.810，经DeLong‘s检验表明均有显著改善。在多变量逻辑回归中，调整AFP（log10转化后）、Child-Pugh分级、BCLC分期和治疗方案后，更高的IFN-γ⁺细胞毒性淋巴细胞百分比仍与治疗应答独立相关：IFN-γ⁺CTL%、IFN-γ⁺NK%、IFN-γ⁺NKT%均有显著的正向关联。相关性分析表明，较高的IFN-γ⁺细胞毒性淋巴细胞亚群百分比与治疗期间AFP和PIVKA-II的下降（即Δlog10值为负）显著相关。

3.5 循环IFN-γ水平与基于PD-1/PD-L1治疗的反应无关

尽管IFN-γ⁺细胞毒性淋巴细胞的百分比与治疗反应密切相关，但基线血清IFN-γ浓度在应答者中反而低于非应答者。血清IFN-γ的ROC分析得到的AUC为0.67，区分能力有限。

4 讨论

基于PD-1/PD-L1的治疗已广泛应用于临床，但仍有相当一部分患者无反应，迫切需要能够预测疗效的生物标志物。本研究系统分析了接受PD-1/PD-L1治疗的HCC患者的外周免疫特征。结果显示，ICT+TKI治疗提高了外周CD8⁺T细胞比例，但治疗反应性与这些细胞的功能状态，尤其是其产生IFN-γ的能力，关联更为紧密。值得注意的是，在所有细胞毒性亚群中，IFN-γ阳性的CD8⁺T细胞和NKT细胞的频率与临床反应的相关性最强。研究发现，较高的IFN-γ⁺细胞毒性淋巴细胞比例与肿瘤标志物（尤其是PIVKA-II）的下降相关，这提示它们与肿瘤消退存在联系。与细胞内IFN-γ测量结果相反，血清IFN-γ浓度在应答者中较低，这可能反映了IFN-γ的来源和生物学背景不同。与肿瘤浸润淋巴细胞相比，外周淋巴细胞更容易获取，是实现动态、无创监测更实用的生物标志物来源。本研究存在一定的局限性，如样本量较小、数据源于回顾性研究且采血时间点不统一，结论需要在独立队列中进行前瞻性验证。总之，对外周细胞毒性淋巴细胞，尤其是其IFN-γ产生能力的功能性免疫分析，能更精确地反映肿瘤特异性免疫能力，并与临床获益更密切相关。将这些细胞免疫检测指标与传统的临床和生化指标相结合，有望改善患者分层并指导免疫治疗决策。