《Frontiers in Microbiology》：Cement hardening reshapes soil microbial diversity, network stability and ecological functions of industrial area
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本研究系统揭示了工业区土壤水泥硬化对微生物群落的深远影响。水泥硬化减少了外源养分输入和重金属积累，显著改变了细菌和真菌的多样性及组成，导致微生物共现网络结构更复杂但稳定性降低。同时，群落组装机制转向确定性过程，功能潜力也随之变化：细菌呼吸功能增强而外源化合物降解能力减弱，真菌腐生功能下降。这些发现为理解人为土壤封闭的生态后果提供了新见解，并对工业区的生态管理具有重要指导意义。
1 引言
快速的城市化与工业化导致大量自然和农业土壤被建筑物、道路及其他不透水表面覆盖。根据全球年度城市土地覆盖比例数据集，不透水表面积几乎翻倍。作为一种普遍的土地封闭形式，水泥硬化显著改变了局部气候，扰乱了水文循环，加剧了环境污染，并削弱了土壤碳汇。这些不透水表面共同导致了景观破碎化、土壤退化以及通过改变斑块尺度的扩散和环境条件而造成的微生物栖息地丧失。土壤微生物支撑着生物地球化学循环、污染物降解和生态系统稳定性等关键生态过程，因此，理解水泥硬化对土壤微生物群落的影响对于城市生态系统管理和海绵城市建设至关重要。
水泥硬化阻碍了土壤与大气之间气体、水分和养分的交换，深刻地影响着微生物群落。例如，人行道和道路下的水泥硬化改变了总碳、总氮、碳氮比和含水量，导致微生物生物量、活性和碳储存潜力降低。不透水表面引起的环境变化，如土壤pH值和铵态氮，强烈重塑了湿地中细菌的组成和多样性。类似地，砌石护岸影响土壤有机碳和质地，从而抑制城市潮汐河岸带的微生物反硝化作用。这种影响还延伸到共生真菌，不透水铺装改变了菌根真菌的多样性和活性，并减少了城市树木的菌根定殖。这些研究考察了沿着广泛城市化梯度（如基于人口密度或土地利用转变）的微生物响应。然而，这种基于梯度的方法通常包含混杂因素，如不同的土壤类型、管理历史和污染源，使得难以分离物理封闭本身的具体效应。此外，工业区——以高强度人为压力和极端胁迫（如土壤压实、污染物积累和养分失衡）为特征——在城市景观中仍然是一个被严重忽视但至关重要的微环境。物理封闭（水泥硬化）与工业特异性胁迫的独特结合，可能引发比一般城市环境中观察到的更复杂和更显著的微生物变化。因此，关于水泥硬化如何直接影响工业环境中土壤微生物群落的系统性和受控评估仍然缺乏。
除了生物多样性丧失，关于水泥硬化的研究还应关注其对微生物共现模式和组装过程的影响。高不透水表面覆盖率通过改变土壤特性（如pH、温度、湿度、碳氮比和硝酸盐水平）不成比例地影响微生物连通性。在高度城市化的环境中，共现网络通常由泛化种主导，导致结构简化和不稳定的群落。集约化土地利用同样降低了细菌网络的复杂性，并将枢纽类群从富营养型转变为寡营养型。这些拓扑变化可以重塑微生物群落结构、组装机制和生态系统功能。然而，水泥硬化在工业环境中调节微生物共现模式、组装过程和生态结果方面的具体作用仍不清楚。
在本研究中，我们通过对16S rRNA和ITS基因的高通量测序，比较了五个不同生产类型的工业场地中水泥硬化土壤与裸露土壤的细菌和真菌群落。采用配对采样设计以隔离水泥硬化的影响，避免先前土地利用历史的干扰。我们旨在解决以下问题：（i）细菌和真菌多样性对水泥硬化的响应；（ii）水泥硬化引起的微生物共现网络和群落组装过程的重组；（iii）水泥封闭条件下重塑细菌和真菌群落结构和功能的关键驱动因素。
2 材料与方法
2.1 研究地点与土壤采样
土壤采样点位于中国东部山东省临沂市。作为中国的国家制造业基地，临沂市拥有多种工业生产类别。该地区属温带季风气候，年平均降水量为799.9毫米，年平均气温为15.0°C。
为了捕捉工业环境的自然异质性并稳健地测试水泥硬化对土壤生态系统影响的普遍性，采用了分层选择方法。我们选择了代表该地区两个主要工业类别（化工制造和合成材料及加工）的五个工厂场地，每个场地由不同的生产活动和相关的潜在土壤污染特征定义。这种设计确保我们的发现不是针对单一工厂类型的特例，而是反映了工业景观中更广泛的模式。所有场地均位于临沂市内，以控制宏观气候和广泛土壤类型的变化。关键的是，在每个工厂内，采用配对样地设计，以隔离水泥硬化的效应。选定的工厂包括：代表化工制造类别的平邑县化肥生产商 Fenyan Co., LTD. (FY)；代表合成材料和加工类别的兰山区和罗庄区的 Zhuoyue Wood Industry Co., LTD. (ZY，胶合板) 和 Anfen Chemical Co., LTD. (AF，聚乙烯)；同样属于化工制造但侧重于冶金的莒南县的 Yaocheng Nickel-Chromium Alloy Co., LTD. (YC，镍铬合金)；以及代表合成材料及加工的罗庄区的 Shenyan Group Co., LTD. (SY，泽塔)。
土壤采样于2023年11月在临沂市的五个工厂进行，采用配对采样设计。在每个工厂内，建立了六个相邻的采样样地对，均匀分布在工厂场地内。每个对包含一个水泥硬化样地和一个相邻的未封闭裸露土壤样地，两者共享相同的封闭前土地利用历史。对于水泥硬化样地，首先通过刷洗和用蒸馏水冲洗去除水泥表面碎屑，以尽量减少对地下样本的表面污染。然后使用履带式岩芯钻机，在无菌蒸馏水冷却下，切割水泥层并提取直径20厘米的水泥岩芯。人工移除水泥岩芯后，暴露出下方未受干扰的土壤表面。将灭菌的聚乙烯管垂直插入土壤剖面，收集0至20厘米深度的地下土壤岩芯。对于相邻的裸露土壤样地，使用手动T型土壤采样器垂直收集土壤岩芯。采样器在样地之间用75%乙醇消毒。在每个样地中，从随机位置收集三个土壤岩芯并混合，形成每个样地的一个复合样本。总共获得60个土壤样本，包括30个裸露土壤样本和30个水泥硬化土壤样本。所有土壤样品均过2毫米筛以去除石块和植物残体，并带回实验室。一部分土壤样品风干用于土壤理化分析，第二部分储存在-80°C用于土壤微生物DNA提取。
2.2 土壤理化分析
土壤湿度通过比较新鲜土壤在105°C烘干至恒重前后的重量来测定。使用土水比分别为1:2.5和1:5的悬浮液，通过pH计和电导率仪测量土壤pH值和电导率值。土壤有机质通过灼烧损失法估算。样品在105°C干燥24小时后称重，然后在550°C加热6小时并重新称重，以重量百分比确定有机质损失。总碳和总氮含量通过元素分析仪测定。土壤总磷、总钾和总重金属含量在用硝酸、氢氟酸和高氯酸混合酸消解后，使用电感耦合等离子体发射光谱法测定。
2.3 扩增子测序
从500毫克冷冻土壤样品中提取总基因组DNA。使用NanoDrop?检查DNA质量和纯度。使用引物对扩增细菌16S rRNA基因的V3至V4区域和真菌rRNA基因的ITS1-1F区域。PCR产物纯化后构建测序文库，并在测序平台上生成单端读长。
使用QIIME 2进行微生物组生物信息学分析。原始序列数据经过去复用、质量过滤、去噪、合并和去除嵌合体等步骤。非单例扩增子序列变体用于构建系统发育树，并使用分类器针对细菌和真菌序列的参考数据库进行分类分配。
2.4 微生物生态网络分析
基于Spearman相关矩阵，使用分子生态网络分析管道构建微生物共现网络。计算网络拓扑属性，包括连接度、平均度、平均路径长度、直径、平均聚类系数、中心化和模块化。进行稳健性分析以评估网络稳定性，通过随机移除或定向移除一定比例的节点来模拟物种丢失。
2.5 微生物群落组装机制
利用R包计算ASVs的生态位宽度，以衡量生境特化模式。通过置换算法模拟ASVs出现情况，确定生态位特化。ASVs被分类为泛化种或特化种。基于分类学指标计算β最近分类单元指数，以评估确定性机制与随机性机制在群落组装中的重要性。
2.6 微生物功能预测分析
使用BugBase、PICRUSt2和FAPROTAX软件预测裸露土壤和水泥硬化土壤中土壤微生物群的潜在细菌功能，并基于真菌分类群使用FUNGuild数据库预测真菌功能。首先将稀疏化的分类单元表转换为功能表，然后根据每个样本的序列数计算每个功能组的相对丰度。
2.7 统计分析
计算Chao1和Shannon指数等α多样性指数以衡量细菌和真菌群落结构，使用丰富度、Pielou均匀度和Shannon指数估计细菌和真菌群落功能。使用基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度分析和主成分分析来呈现微生物群落结构和功能在两组土壤样品间的异质性。进行相似性分析以显示差异显著性。分析物种替换和物种丰富度差异对微生物群落总β多样性的贡献。通过Wilcoxon符号秩检验分析土壤理化因子、微生物群落结构的α多样性指数以及优势微生物门、属和功能性状相对丰度的显著差异。通过单因素方差分析评估工厂位置和水泥硬化时间对每种土壤性质的显著影响。使用典型相关分析和Mantel检验将微生物群落结构与土壤变量联系起来。使用偏最小二乘路径建模分析水泥硬化对土壤变量、微生物群落组成和多样性以及微生物功能组成和多样性的影响。
3 结果
3.1 土壤环境变量
土壤理化性质在五个工厂场地间表现出相当大的差异。水泥硬化下的土壤理化性质倾向于偏离裸露土壤，如主成分分析所示。具体而言，水泥硬化显著增加了土壤湿度，降低了土壤有机质、总碳和总钾的含量。观察到工厂位置和水泥硬化时间对土壤电导率值和土壤养分（如有机质、总碳、总氮、总磷和总钾）的显著影响。水泥硬化土壤的土壤电导率和pH值高于裸露土壤。此外，水泥硬化对土壤总氮的影响与总碳一致，但增加了土壤有效氮水平。虽然未观察到对总重金属水平的显著封闭效应，但水泥硬化降低了土壤总铬、总镍、总铅和总砷的含量。
3.2 微生物群落结构的变化
裸露土壤与水泥硬化土壤之间的细菌Chao1值没有显著差异，但随着土壤被水泥封闭，Shannon指数下降。水泥硬化土壤的真菌丰富度和多样性显著低于裸露土壤。非度量多维尺度图揭示了土壤封闭后细菌和真菌群落的分化，相似性检验进一步表明裸露土壤与水泥硬化土壤的细菌和真菌群落结构高度不同。β多样性分解分析表明，物种替换过程主导了所有研究样本中细菌和真菌群落组成的差异性。水泥硬化显著降低了细菌群落中多个门的相对丰度，但增加了厚壁菌门的相对丰度。对于真菌群落，观察到水泥封闭下担子菌门、接合菌门、球囊菌门和壶菌门的相对丰度下降，而子囊菌门的相对丰度增加。在属水平上，水泥硬化导致多个细菌属和真菌属的相对丰度显著下降，反之，它显著增加了包括芽孢杆菌属、苍白杆菌属等在内的细菌属的丰度。
3.3 微生物共现网络
土壤水泥硬化明显改变了土壤微生物共现网络的拓扑特性，特别是真菌网络。水泥硬化土壤的细菌网络比裸露土壤的网络大得多。虽然真菌网络的节点数略有下降，但其连接数和直径分别是裸露土壤的2.3倍和1.2倍。此外，与裸露土壤相比，观察到水泥硬化土壤中细菌和真菌群落的网络更复杂。相反，随着土壤水泥封闭，微生物网络的模块化网络和随机模块化降低。
通过模拟随机和定向分类群移除来评估微生物网络的稳健性。在随机分类群丢失下，水泥封闭土壤中的细菌和真菌网络表现出与裸露土壤相当的稳健性。值得注意的是，基于定向分类群移除，水泥硬化土壤中的细菌网络表现出比裸露土壤更高的稳健性。相比之下，真菌网络表现出相反的反应模式，水泥硬化土壤的稳健性相对于裸露土壤显著降低。
3.4 微生物群落组装机制
应用生态位宽度评估水泥硬化后微生物的生境特化模式。水泥硬化显著降低了细菌群落的生态位宽度，伴随着特化种比例显著增加和泛化种相应减少。相比之下，真菌群落在水泥硬化条件下仅表现出生态位宽度的边际增加。确定性过程对水泥硬化土壤中细菌和真菌群落组装的影响比裸露土壤更强。水泥硬化显著增强了微生物群落组装中的异质选择过程。特别是对于真菌，确定性异质选择过程几乎占了水泥硬化土壤中观察到的系统发育变异的全部，其程度比细菌中观察到的更大。
3.5 微生物群落功能预测概况
对裸露土壤和水泥硬化土壤中细菌和真菌扩增子序列变体的推定代谢或生态功能进行了比较分析。水泥硬化不影响细菌α多样性（丰富度），而Pielou均匀度和Shannon多样性指数均呈现显著降低。相比之下，真菌功能α多样性在水泥硬化响应中在所有指标上均表现出显著下降。主成分分析显示，在水泥硬化条件下，细菌和真菌的功能组成均存在显著差异。
如BugBase分析所预测，土壤水泥硬化显著降低了与形成生物膜、革兰氏阴性菌以及好氧和厌氧分类群相关的细菌功能组的相对丰度，同时富集了潜在致病菌、可移动元件、革兰氏阳性菌和兼性厌氧菌。PICRUSt2分析表明，水泥硬化对与膜运输、聚糖生物合成和代谢以及外源化合物生物降解和代谢相关的途径产生了显著的负面影响。相比之下，与转录、核苷酸代谢、细胞运动、萜类和聚酮类代谢、辅因子和维生素代谢以及氨基酸代谢相关的功能组显著增强。FAPROTAX注释表明，与裸露土壤相比，水泥硬化土壤中的化能异养、好氧化能异养和芳香族化合物降解显著下降。相反，与发酵、硝酸盐还原、硫化合物/硫酸盐呼吸和产甲烷作用相关的代谢途径呈增加趋势。真菌功能也受到显著影响，水泥硬化降低了所有采样点中主要生态角色的相对丰度，如内生菌、木材/土壤/凋落物/植物/粪便腐生菌、动物病原菌、地衣寄生菌、真菌寄生菌、外生菌根真菌和附生菌。
3.6 土壤变量与微生物群落结构和功能之间的联系
Mantel检验揭示了土壤湿度、总碳和工厂位置对细菌和真菌群落均有显著影响。此外，总铅、总氮和有机质含量对细菌群落组成有很强的影响，而总铬和总镍显著塑造了真菌群落结构。典型对应分析进一步表明，细菌和真菌群落结构与土壤湿度、电导率、工厂位置以及铬、镍、铅、氮和碳的总量密切相关。此外，水泥硬化时间、总钾和有机质也显著影响真菌群落结构。热图分析说明了土壤环境变量对优势细菌和真菌门相对丰度的影响。具体而言，土壤湿度、电导率和pH值与酸杆菌门和放线菌门的丰度呈负相关，但与硝化螺旋菌门呈正相关。土壤中总重金属含量对酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门和拟杆菌门的相对丰度有积极影响。此外，酸杆菌门和芽单胞菌门与总氮、总碳和有机质呈正相关。对于真菌门，土壤湿度和pH值显著影响优势真菌的相对丰度。值得注意的是，重金属含量在驱动裸露土壤和水泥硬化土壤之间真菌分布差异方面的作用比土壤养分成分更大。在属水平上，土壤湿度、总碳和工厂位置与苍白杆菌属、诺卡氏菌属和稍热菌属的细菌丰度显著相关。总铅和砷含量对苍白杆菌属、RB41、MND1和盖勒氏菌属的相对丰度有负面影响。稍热菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属与有机质、总磷和有效氮呈正相关。对于真菌属，被孢霉属与土壤铬、总镍和总钾呈正相关，但与土壤湿度和电导率呈负相关。此外，土壤有机质和总碳与链格孢属和茎点霉属呈正相关。
偏最小二乘路径建模分析阐明了水泥硬化对细菌和真菌群落结构和功能多样性的影响。水泥硬化对细菌群落组成和多样性产生直接影响，进而间接影响细菌功能组成和多样性。此外，土壤性质和养分水平与细菌群落多样性和功能多样性均表现出显著关系。相比之下，水泥硬化直接影响真菌群落组成和功能多样性，同时间接调节真菌功能组成和群落多样性。此外，土壤性质和养分在塑造真菌功能多样性方面发挥了直接作用。
4 讨论
水泥硬化显著改变了土壤理化性质。土壤pH值和电导率水平的升高与城市化引起的变化一致，这可能是由于水泥水化过程中氢氧化钙的释放以及碳酸氢盐和钾离子随时间的溶解所致。水泥层下的土壤压实减少了孔隙空间，增加了容重。因此，增强的毛细作用促进了土壤对地下水中溶解离子的吸附，导致土壤电导率升高。与先前研究相反，封闭土壤的水分含量高于开放土壤，这可能是因为在废弃工厂场地干燥季节采样且没有灌溉。水泥硬化土壤中重金属浓度降低，这与直接人为输入的减少有关，如土壤回填、施工过程、燃煤和汽车尾气。然而，雨水侵蚀可能加剧了未封闭土壤的非点源污染。水泥硬化土壤中有机质、总碳、氮和钾的显著减少归因于有限的植物凋落物输入以及与大气交换的隔离。这种隔离通过限制底物和养分输入阻碍了微生物生物量的维持，而气体排放和水分流失进一步耗竭了碳和氮库。
水泥硬化显著影响了细菌和真菌群落的多样性和组成。真菌α多样性指数比细菌多样性下降更剧烈，表明真菌对封闭更敏感。真菌多样性对水泥硬化更敏感，这与更广泛的观察结果一致，即真菌群落通常比细菌更容易受到土壤中物理干扰和重金属毒性的影响。真菌作为分解者、植物共生体和病原体发挥着重要的生态作用。不透水覆盖物下的养分稀缺、pH值升高、氧气有限和缺乏光照可能降低了微生物生物量。水泥硬化土壤与裸露土壤之间的β多样性存在显著差异，物种替换分别占细菌和真菌组成差异的74.9%和71.1%，这表明水泥硬化塑造的生境导致许多土壤物种消失或更替。富营养型物种在水泥硬化土壤中减少，而厚壁菌门在不透水条件下受到青睐，这表明其对极端环境具有耐受性。
水泥硬化下细菌和真菌网络复杂性的增加与关于封闭城市草坪和压实森林土壤中微生物网络简化的报道形成对比。这种差异可能源于工业场地独特的基线条件。与那些生态系统不同，裸露的工业土壤经历了高度的空间异质性和慢性金属胁迫，导致了生态位碎片化和网络不稳定。共现网络的拓扑结构表达了微生物与环境之间的直接和间接关系。水泥硬化土壤中更高的连接数、连接度、平均度、聚类系数和中心化，以及更
